2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒアルロン酸を用いた外来抗原ペプチドデコレーションによるがん細胞の抗原性の改変
| Project/Area Number |
18K12082
|
|---|
| Research Institution | The University of Kitakyushu |
|---|
Principal Investigator |
望月 慎一 北九州市立大学, 国際環境工学部, 准教授 (10520702)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | がんワクチン / 薬物送達システム / 抗原 / 多糖 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
がんワクチンは生体が自ら持つ免疫機能を活性化してがん細胞を攻撃する治療法であるが、多くのがん細胞はそうした免疫細胞からの攻撃を回避するためにがん抗原の提示量を減らしている。本研究では、がん細胞上の目印となる抗原分子をより抗原性の高いものへ薬物送達システムを利用して置換させることである。
初年度に作製したヒアルロン酸（HA）と抗原のオボアルブミン（OVA）から成るHA-OVAコンジュゲート体に関し、がん細胞に対する応答を評価した。HA-OVA処理したがん細胞とOVA特異的細胞傷害性T細胞（CTL）を有する脾細胞を混合させると、強力なサイトカイン（インターフェロンγ；IFN-γ）産生が観察された。これは、がん細胞が取り込んだOVAの一部を細胞表面上に提示し、CTLが反応したことを示している。また、OVAのみを処理したがん細胞群ではIFN-γの産生が少なかったことから、コンジュゲート体に関してはHAを介して効率よくOVAが取り込まれていることが分かった。今後は添加するHA-OVAの量やCTLとの混合比を変えて比較検討する予定である。
また、がん細胞の中にはCTLからの攻撃を避けるために抗原を提示する分子（MHCクラスI分子）を提示するのを抑制しているがん細胞もある。そうしたがん細胞に対してCTLの感受性を回復させるために二重鎖RNAに注目した。がん細胞内には二重鎖RNAに応答してMHCクラスI分子の発現が誘導されることが知られている。OVAの時と同様にHAのカルボキシル基を用いてオリゴシトシンとのコンジュゲート体（HA-oligoC）を作製し、poly Iを添加することで二重鎖RNAを含むHA架橋体を作製することに成功した。しかし、未反応のHA-oligoCやpoly Iも確認されるため、今後は両者の仕込み比を変えることで反応効率の向上を図る。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Balb/cマウスにOVAとアジュバントとしてCpG-DNAを皮内に２回免疫を行い、２回目の免疫から１週間後に脾細胞を採取した。一方、マウス大腸がん細胞（CT26）に作製したHA-OVAコンジュゲート体を添加し、24時間後に先の脾細胞と混合させ、さらに24時間培養後に上清中のインターフェロン－ガンマ;（IFN-γ;）量を酵素結合免疫測定法（ELISA）で評価した。OVA処理がん細胞と同脾細胞混合液と比較し、コンジュゲート体処理群からは有意なIFN-γの産生が観察された。この結果よりがん細胞がHAを介してOVAを取り込み抗原としてOVAを細胞表面上に提示し、OVA特異的T細胞がそれに応答していることを示している。これより本研究の基本的概念となる外来抗原を人為的に提示させることで強い免疫応答を誘導可能であることが示された。
また、CTLからの攻撃を避けるためにMHCクラスI分子の発現を抑制しているがん細胞（例；マウスメラノーマ細胞）に対しても同様の効果を誘導するために二重鎖RNA修飾HAの作製を試みた。HAのカルボキシル基に対し架橋分子を介してオリゴシトシン40merを結合させた。このHA-oligoCコンジュゲート体に対しポリイノシン酸（poly I）を添加し、二重鎖RNAを介したHA架橋体を作製した。高分子量体のpoly Iよりも大きさが小さくなっていたことから複数のHA-oligoCコンジュゲート体が凝集して小さく折りたたまれていることが分かった。しかし、まだ未反応のコンジュゲート体も観察されるため、poly Iの混合比を検討することで架橋複合体作製の最適化を今後行う。
|
| Strategy for Future Research Activity |
HA-OVAコンジュゲート体処理によりがん細胞に対してOVAを提示させることに成功したが、どれくらい効率よくOVAが取り込まれているのか定量的評価を今後は行う。OVAの余ったアミノ基に対して蛍光分子（FITC）を修飾し、がん細胞に添加、各時間に蛍光顕微鏡観察あるいはフローサイトメトリーにより、取り込み量を定量する。現在モデルに使用しているCT26細胞は過剰にHA受容体のCD44を発現しているが、得られたコンジュゲート体がCD44を介して取り込まれるかどうか、CD44ノックアウト細胞を作製し、取り込み量の変化からそのメカニズムを明らかにする。また、CT26を皮下に移植したマウスを用意し、HA－OVAコンジュゲート体を直接投与し、in vivoで効率よくOVAが腫瘍組織に取り込まれるか検討する。
HA-二重鎖RNA作製に関し、未反応のHA-oligoC及びpoly Iが残らないようにそれぞれの混合比を変えて検討し、最適化を行う。得られた架橋体をMHCクラスI分子を発現していないがん細胞に添加、各時間におけるインターフェロン産生及びMHCクラスI分子に対する抗体染色を行い発現誘導の有無を確認する。HAを介して二重鎖RNA及び抗原の送達が可能になればあらゆるがん細胞に対して抗原の改変が可能になると期待される。
|
| Causes of Carryover |
当初予想していたよりも少ないタンパク量、ヒアルロン酸量で、コンジュゲート体作製及びその免疫応答の基礎実験を行うことが出来たため、本年度の使用額をその分抑えることが出来た。次年度は、この分と併せて得られたコンジュゲート体の細胞実験、動物実験に、さらには二重鎖RNA送達実験に使用する予定である。また、細胞実験までの結果が得られれば薬学系の学会での発表の機会も設けたいと考えている（そのための旅費に使用予定）。
|
