2019 Fiscal Year Research-status Report

Development of effective pre-treatment method for the detection of Mycobacteria

Research Project

Project/Area Number	18K12125
Research Institution	公益財団法人結核予防会結核研究所
Principal Investigator	御手洗聡公益財団法人結核予防会結核研究所, 抗酸菌部, 部長 (30501671)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	結核菌 / 誘電泳動 / 診断 / 高感度化
Outline of Annual Research Achievements	結核菌の臨床検体からの分離については、現在最も高感度な液体培養法でも100 CFU～/mL程度の菌濃度を必要とし、肺結核患者全体の80%強までしか細菌学的に証明できない。さらに検体中の結核菌濃度が低いほど培養陽性までに時間がかかる。核酸増幅法は迅速だが感度の点で液体培地に劣る。原因は検体中から迅速性と感度を確保するのに十分な結核菌を回収・濃縮できないことにあり、この問題を解決し、結核菌検査を高感度化・迅速化するため、臨床検体からの抗酸菌検出感度を現時点の100倍程度（1 CFU/mL程度）に高めることを目的とする。臨床検体からの結核菌検出感度が高くなることにより、より正確な細菌学的診断が可能となる。平成30年度は臨床分離株を含む複数の結核菌株を培養し、懸濁液を作製した。臨床検体に関しては、均質化処理後の喀痰で懸濁液をBufferに置換することで誘電泳動法に適切な検体を作製することが可能であることを示した。合わせて結核菌を捕獲するのに最適な電流・電圧および周波数を特定した。令和1年度は平成30年度に作製した懸濁液の改良と結核菌を捕捉する誘電泳動条件の再検討、ならびに機器の改良を検討した。懸濁液としてスクロースとグルコース水溶液、Tween 80%の溶液溶液で導電率1 μS/cmのBufferを作製した。誘電泳動の最適設定は周波数100 kHz、電圧 10 V、流速 0.5 mL/hと決定した。誘電泳動機器をファンクションジェネレーターに変更し、捕捉効率を約2倍とした。また、捕捉面積を増やしたチップを使用することで、捕捉率が向上した。誘電泳動により菌が捕捉・濃縮されるものの、チップに菌が付着して十分な回収ができないことが問題となっている。共同研究者と機器の改良中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 誘電泳動法は検体の導電率が結果に影響するため、より導電率が低いBufferが必要であった。スクロースとグルコース水溶液に0.05% Tween 80%を添加した溶液に、SMNUPBを加えてイオン交換を行い、導電率1 μS/cmと平成30年度に使用していたBufferより低い導電率のBufferを作製した。誘電泳動の条件は上記Bufferに懸濁したBCGを誘電泳動で捕捉しReal-time PCRで定量的に測定した。その結果、誘電泳動の最適設定は周波数100 kHz、電圧 10 V、流速 0.5 mL/hと決定した。上記検体の改良により検体濃縮は現時点では最大16倍（検体量2 mLで誘電泳動を行った場合）である。捕捉率はチップから菌の回収に問題があるため正確に算出できていないが40%程度と見込まれている。今後臨床検体での検討に移るにあたり、大きく2つの問題がある。1つ目は捕捉率の問題である。現時点では40%程度であるが、抗酸菌検査における通常の前処理を行った検体1mLを誘電泳動に使用するとして40%の菌を捕捉し全て回収できた場合、8倍の濃縮効果が得られるが、この程度では感度上昇にあまり寄与しない。2つ目はチップに捕捉したBCGを回収する際に菌がチップに付着し全ての菌を回収できない点である。LipidureやBSA溶液でコーティングしたチップで菌の付着を防ぐよう試みるも菌回収効率は軽度上昇に留まっている。
Strategy for Future Research Activity	誘電泳動を用いて定量的に結核菌を回収するための泳動条件の設定は終了しているものの、チップ内にトラップされた結核菌を効率的に回収する方法が確定していない。チップ内を乱流で撹拌しながら回収する方法を考案したので、来年度はその方法を検討する。また、来年度は、これまでのような定量的濃縮効率評価では無く、通常培養で検出閾値以下の濃度検体から微量の結核菌を完全回収し、定量的ではない定性的感度比較を実施する。
Causes of Carryover	誘電泳動を用いて定量的に結核菌を回収するための泳動条件の設定は終了しているものの、チップ内にトラップされた結核菌を効率的に回収する方法が確定していない。チップ内を乱流で撹拌しながら回収する方法を考案したので、来年度はその方法を検討する。また、来年度は、これまでのような定量的濃縮効率評価では無く、通常培養で検出閾値以下の濃度検体から微量の結核菌を完全回収し、定量的ではない定性的感度比較を実施する。このことにより、従来法よりも高感度化しているか否かを直接定性的に比較する。