合成生物学ツールとしての酵母オペロン型遺伝子発現系の「再開発」

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K14374
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 冨永 将大 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 学術研究員 (50761409)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 遺伝子発現

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は, 通常一つのmRNAから一つの遺伝子しか発現しない酵母において, 一つの mRNAから複数の遺伝子を効率よく発現できる"オペロン型"の遺伝子発現系を樹立することである。
今年度は， IRESと呼ばれる既知の翻訳促進配列について，酵母内活性の強化を試みた (項目2)。まず，前年度に見出した酵母内でほとんど活性を示さないIRESについて，その原因の特定を試みたところ，一部のIRESではその導入によってレポータ遺伝子の転写量が低下することが明らかになった。次年度には，この点についても工学を行う予定である。次に，前年度に確立した，IRES活性のハイスループットな評価系を用いて， IRES活性に影響を与える細胞内因子を探索したところ，その発現を亢進することによってIRES活性を高める遺伝子を同定できた。このような因子について，他の真核生物種に由来するホモログ遺伝子や，人工的に作製した変異型の遺伝子を検討したところ，さらなる酵母内IRES活性の向上にも成功した。このように，IRESを利用した遺伝子発現系の確立に向けた準備は整いつつある。また，前年度に開発したIRES活性のハイスループットな評価系の堅牢性をさらに高めるために，酵母遺伝子の発現をON/OFF制御する誘導系も別途開発した。これにより，IRES活性をさらに効率よく評価できるようになった。このような改良型のスクリーニング系も利用しながら，次年度は，同定した因子を進化工学によって改変し，IRESを介した遺伝子発現のさらなる高効率化を目指す。またIRES自体の配列改変によるその活性改良も継続する。最終的には，得られるオペロン型の遺伝子発現系を利用して，複数の遺伝子からなる代謝経路を構築し，開発したオペロン型遺伝子発現系の適用限界を調べる予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度に確立したIRES活性の評価系を用いたスクリーニングの結果，酵母内でほとんど活性を示さないIRESを複数見出した。その原因の特定を試みたところ，IRESの導入によってレポータ遺伝子の転写量が著しく低下することが明らかになった。さらに，酵母内在の翻訳因子の過剰発現を検討したところ，IRES活性の向上に寄与する遺伝子を見出した。この遺伝子について，他の真核生物種のホモログや部位特異的な変異導入を検討したところ，さらなるIRES活性の向上に成功した。また，IRES活性の評価系そのものの改良も同時に進行中である。このように，IRESを利用した遺伝子発現系の確立に向けた準備は整いつつある。

Strategy for Future Research Activity

本年度までで，IRES活性に重要な，すなわち工学の対象にするべき因子を絞り込むことができた。次年度は，対象を絞った集中的な工学によりIRES活性を高め， 項目4で標榜した「IRESを使ったポリシストロニック遺伝子発現による代謝経路の構築」に着手する。具体的には，(1) 翻訳因子にランダム変異を導入することでその変異体ライブラリを作製する，(2) 確立したIRES活性のスクリーニング/セレクション法によって，より高いIRES活性をもたらす翻訳因子変異体を取得する。(3) それらの遺伝型および表現型を解析する。加えて，IRES配列自体の進化工学も継続する。こうして同定した全ての有用因子を一つの酵母株へ集約したあと，代謝経路を構成する酵素群，例えばカロテノイド合成酵素について，IRESを使った同時発現を試みる。

Causes of Carryover

増員予定であった技術補佐員が予定通りに雇用できなかったため，繰越が生じた。
主として、持ち越し分と次年度分を合わせた予算は、本研究に専心する研究員の人件費および消耗品費として使用する。