2018 Fiscal Year Research-status Report
Functional analyses and applications of novel factors involved in the biosynthesis of Coenzyme Q10
| Project/Area Number |
18K14377
|
|---|
| Research Institution | Shimane University |
|---|
Principal Investigator |
西田 郁久 島根大学, 総合科学研究支援センター, 客員研究員 (20784531)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | コエンザイムQ10 / 分裂酵母 / ミトコンドリア / 生合成 / p-ヒドロキシ安息香酸 / PKA1 / グルコース / 炭素源 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
CoQ生合成に関わる様々な新規因子の解析を行った。
これまでに、CoQ10の新規生合成因子であるCoq12がCoQ10の生合成に関わることが明らかとなっている。平成30年度は、Hisタグを付加したCoq12を大腸菌もしくは分裂酵母から精製し、生化学的な解析を行った。その結果、分裂酵母から精製したCoq12タンパク質に分裂酵母のエタノール抽出物を基質として添加した際にNAD+の還元活性が検出された。野生株と比較して、coq12破壊株より得た抽出物を基質にすると高い活性が得られた。現在、その基質の特定を試みている。
また、分裂酵母におけるCoQ10の生合成はグルコース応答により制御されていることが示唆されたため、その主要経路であるcAMP/PKA経路に着目した。3%グルコースを含むYES完全培地でcgs1, cyr1, git3, gpa2, pka1の各遺伝子単独破壊株のCoQ10量を測定したところ、cyr1, git3, gpa2, pka1の単独破壊株におけるCoQ10量は野生株の約1.5～2倍に増加し、cgs1破壊株では0.7倍に減少した。この結果は、グルコース濃度依存的にCoQ10量が変化する結果と一致する。このことから、分裂酵母においてCoQ10の生合成はPKAによって負に制御されている可能性が示唆された。また、pka1を破壊すると、グリセロール・エタノールを炭素源とする非発酵性炭素源培地において生育が向上し、野生株と比較してCoQ10量も増加した。cgs1やpka1の単独破壊株においてウエスタンブロッティングによる発現解析を行ったところ、いくつかのCoQ生合成酵素の発現が変動した。これらを学会発表で報告し、学術論文へも投稿中であり、平成31（令和元）年度の公表が決定している。
さらに、共同研究として、CoQとホスポリパーゼA1の代謝系の関連性の解析において学術論文の公表、顕微ラマン分光法を用いたCoq-GFP融合タンパク質の検出系の検討において国際学会発表を行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要に示したとおり、CoQに関する様々な研究課題において、成果が得られた。今回、新規CoQ生合成タンパク質であるCoq12の精製が可能となり、Coq12の推定基質が分裂酵母エタノール抽出物の中に含まれていることが明らかとなった。また、CoQ10の生産性を調節するcAMP-PKA経路の因子が、CoQの生産性や、CoQ生合成酵素の発現調節に関わっていることを見いだした。また、培養条件の検討やcAMP-PKA経路の因子の遺伝子破壊株を用いることなどにより、CoQ10の高生産に成功した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、Coq12の基質の同定を中心として解析を行う予定である。Coq12の推定基質を含む分裂酵母のエタノール抽出物を用い、その推定基質を含む画分を分離する。さらに、その物質の同定をHPLCやLC-MS解析等を活用して進める。同様に、coq12の破壊株で蓄積する代謝物を解析する。また、coq12の破壊株の表現型をより詳細に解析し、低下したCoQ10量がストレス耐性や呼吸能に与える影響等も評価する。さらに、coq12破壊株における、他のCoQ生合成酵素の発現等に与える影響を評価する。Coq12以外の新規に単離されたCoQ生合成タンパク質や、その遺伝子破壊株に関しても解析を行っていく予定である。
|
| Causes of Carryover |
物品費の購入が当初予想より少なく済んだため。
|
| Remarks |
受賞等： 特定非営利活動法人 日本コエンザイムQ協会 第16回研究会 奨励賞受賞
学会等での役割： 生物工学会第4回 西日本支部講演会 座長担当
|
