2018 Fiscal Year Research-status Report

糸状菌におけるグルコースキナーゼによる酵素タンパク質生産制御機構の解析

Research Project

Project/Area Number	18K14380
Research Institution	University of Shizuoka
Principal Investigator	田中瑞己静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (70803344)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	麹菌 / カーボンカタボライト抑制 / グルコキナーゼ / ヘキソキナーゼ / 転写因子 / タンパク質分解 / 糸状菌 / トランスポーター
Outline of Annual Research Achievements	麹菌のヘキソキナーゼ(hxkA)とグルコキナーゼ(glkA)の破壊株を作成したところ、hxkAの破壊により著しい分生子形成の阻害が起きたのに対し、glkA破壊では生育への影響は観察されなかった。一方、カーボンカタボライト抑制 (CCR) への影響を調べた結果、いずれの破壊株でもグルコースを添加したデンプン培地でのハロー形成が観察され、glkA破壊株でより大きなハローが観察された。CCR を制御する転写因子 CreA は、グルコース存在下では安定であり、アミラーゼ生産条件であるマルトース存在下では不安定化することが明らかとなっている。両破壊株における CreA の存在量を調べた結果、glkA 破壊株ではグルコース培地においても CreA の存在量が著しく減少したのに対し、hxkA 破壊株では野生株と比較して大きな違いは見られなかった。麹菌においては、グルコース存在条件下で細胞膜上のマルトーストランスポーター(MalP)がユビキチン化され、エンドサイトーシス依存的に液胞に輸送されて分解されることが明らかとなっている。両破壊株におけるグルコース添加後の GFP 融合 MalP をウェスタン解析で検出した結果、glkA 破壊株では GFP-MalP の分解が著しく抑制されていたのに対し、hxkA 破壊株では野生株と同様に速やかに分解されていた。また、MalP のユビキチン化に必要なアレスチン様タンパク質 CreD はグルコース添加後に速やかに脱リン酸化されることが明らかとなっているが、glkA の破壊によって CreD の脱リン酸化が著しく抑制された。以上の結果から、麹菌のグルコース存在条件下におけるアミラーゼ遺伝子の発現抑制には、GlkA が中心的な役割を担っていることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason hxkA 破壊株と glkA 破壊株の解析により、GlkA がグルコース存在下での CreA の安定化、グルコース誘導性 MalP の分解、CreD のグルコース誘導性脱リン酸化に必要であり、麹菌のカーボンカタボライト抑制において GlkA が中心的な役割を担っていることが明らかとなった。グルコキナーゼによるカーボンカタボライト抑制の制御は、出芽酵母などの他の真核微生物においてもこれまでに報告がなく、新規性の高い研究成果が得られたと考えられる。
Strategy for Future Research Activity	1. HxkA と GlkA に GFP を融合し、細胞内局在を調べると共に、炭素源による影響を調べる。 2. 様々な炭素源存在下における hxkA 破壊株と glkA 破壊株における CreA の安定性および CreA の細胞内局在を調べる。 3. hxkA 破壊株と glkA 破壊株における細胞内グルコースキナーゼ活性を調べる。 4. hxkA 破壊株と glkA 破壊株において GFP 融合 MalP の細胞内局在を観察し、glkA 破壊株におけるグルコース誘導性 MalP 分解の抑制がエンドサイトーシスの抑制によるものかを調べる。 5. HxkA および GlkA と CreA の相互作用について検討する。