2019 Fiscal Year Research-status Report
Analysis on the light responsive regulatory system in the epiphytic bacteria Methylobacterium sp.
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18K14381
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| Research Institution | Kyoto University of Advanced Science |
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Principal Investigator |
井口 博之 京都先端科学大学, バイオ環境学部, 講師 (30712020)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 光応答 / 光受容体 / 葉面細菌 / 時計遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
地球上に光は普遍的に存在するが、微生物の光への応答はほとんど調べられていない。本研究では、微生物の生息環境の中でもとりわけ光を受ける環境である葉面に生息するMethylobacterium属細菌において、光応答制御および光エネルギー利用に関する分子機構を調べた。
（１）光受容体遺伝子の転写解析
光照射に応答する遺伝子を網羅的に明らかにし、光応答制御システムの統合的理解につなげるため、マイクロアレイ解析を行った。青色光照射下と暗所とを比較した結果、運動性、ストレス応答、一次代謝に関わる遺伝子が転写量変化が大きいものとして抽出された。また一部の光受容体遺伝子も青色光に応答することが明らかになった。
バクテリオクロロフィル（Bch）遺伝子は発現条件が不明である。そこで発現条件を明らかにするため、Bch遺伝子プロモーターにxylE遺伝子を連結したレポーター系を構築した。
（２）光受容体の光吸収能の解析
研究対象とするM. extorquensは、配列から推定される光受容体遺伝子を10個保有する。それぞれが光受容体としての機能、つまり光吸収能を有することを確認するため、まず大腸菌でのタンパク質生産を試みた。pETシステムを用いたところ2個の光受容体のみ可溶画分からタンパク質を得られた。誘導条件や宿主を様々検討したが、残りの8個のタンパクは取得できなかった。一方で、pColdシステム（低温発現）を用いたところ、計8個の光受容体を可溶画分として得られ、前出の2個の光受容体もより多量のタンパクが取得できた。His-tag融合タンパクとして発現したため、Niカラムで精製し、吸光解析を行った。現在の所、2個で想定される光吸収が確認され、光受容体の機能を持つことが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
光受容体の機能解析に向かうため、光応答や光エネルギー利用に関係する10個超の遺伝子の発現を試みてきた。発現がなかなかうまくいかず、これに多くの時間・労力を費やしてしまった。手法の変更によって多くの遺伝子の発現に成功できたため、これから予定していた研究を進めることができる。
kai遺伝子の制御機構の研究は、タンパク質間相互作用の解析を行っていたが、いくつかのkai遺伝子を発現できないことががネックとなって、今年度はほとんど研究を進められなかった。
初年度に行う予定であったマイクロアレイ解析は、分析に供する培養条件を決定し、受託解析に出して結果を得ることができた。光に応答する遺伝子の全体像を判明できたことから、次年度の研究では、興味深い因子について深く解析を進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
大腸菌でタンパク質を高生産できた光受容体については、タンパク質を精製し、光吸収の特徴を調べていく。発現できていない遺伝子は、引き続き発現条件の検討を行う。
バクテリオクロロフィルの発現については、構築したレポーターを使用して、様々な培養条件を試験していく。
青色光に応答することが判明した遺伝子は、光受容体遺伝子破壊株での転写量を調べることで、各光受容体の制御系との関連付けを行う。
青色光に転写が応答することが判明し、光受容体の機能も確認できた光受容体については、その光吸収ドメインの働きや、下流遺伝子への信号伝達、関与する表現型を詳細に解析して、本菌内での機能や役割を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
前記した理由での研究の遅れにより、予定していた遺伝子工学実験やタンパク質実験が進められず、予算が残ってしまった。問題をクリアして次の実験を展開する道筋を立てられたことから、繰り越した予算も利用して研究を進めていく。
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