2019 Fiscal Year Research-status Report

耐熱性色素依存性D-乳酸脱水素酵素の機能・構造解析とバイオセンサー素子への応用

Research Project

Project/Area Number	18K14394
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	林順司徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 助教 (20802101)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	酵素工学 / 酵素 / 超好熱菌 / 構造生物学
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、立体構造情報を基にバイオセンサー素子として最適な色素依存性D-乳酸脱水素酵素（Dye-DLDH）を開発することである。本研究はD-乳酸の新規測定法開発において重要な役割を果たすと考えられる。超好熱菌・好熱菌のゲノム情報に基づき機能が特定されていない10種類以上のDye-DLDHホモログについて、発現系構築および発現産物の機能と構造解析に取り組んでいる。当該年度では、既に精製に成功している2種の超好熱菌Dye-DLDHに関して結晶化に取り組み、Aeropyrum pernixのDye-DLDHの結晶化と構造解析に成功した（分解能2.0Å）。その結果、A. pernixの酵素には補酵素であるFADが結合しておらず、且つFADの結合に関与すると推定される構造がディスオーダーしていることが判明した。そこでFAD、FMNとの共結晶化を検討したところ結晶を得ることが出来なかった。また高濃度FADを結晶へ浸潤させて、X線回折実験を行ったところ分解能は非常に悪く構造解析に至らなかった。FADを結晶内に取り込ませるための条件を見出すことが今後の課題である。その一方で、A. pernixのDye-DLDHは結晶化が比較的容易であり、且つX線回折実験に最適な大きさの結晶を安定して得るための条件は既に見出している。またFADの結合に関与すると推定されるアミノ酸残基を数種見出すことにも成功した。今後は、本酵素の変異酵素を作製し、FADの親和性または結合性を解析し、FADとの共結晶の作製を目指す。変異酵素のX線結晶構造解析および詳細な酵素化学的諸性質の解明を行うことで、バイオセンサー素子としての有用性を評価していく。さらに、発現に成功しなかったホモログに関しても発現系を再検討する。最終的に複数の酵素を比較することで、バイオセンサー素子として優れた酵素を選抜する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度の研究目標に掲げた、Dye-DLDHの結晶化に成功し、良質な結晶を安定的に得られる条件を見出した。またX線回折実験の結果、その分解能は良好であった。最大の目的であったFADとの共結晶作製は未達成であるが、補酵素FADの結合に関与するアミノ酸残基を見出せた。色素依存性脱水素酵素は膜結合性で可溶化や結晶化が困難という特徴からも、結晶化に成功できたことは大きな収穫である。よって研究進捗は順調であると考えている。
Strategy for Future Research Activity	次年度はA. pernix由来Dye-DLDHの変異酵素の作製とFADとの共結晶化を行い、補酵素結合状態の詳細な構造情報を取得する。得られた情報に基づき酵素の機能解析（基質特異性、電子受容体特異性など）の解析を進める。また野生型酵素についてもFADとの共結晶化が可能な条件を再度検索する。発現に成功している酵素も数種あるため、大量精製の条件を見出し、結晶化と構造解析を行うことも必要である。酵素の触媒機構と電子受容体特異性等に関与する部位を立体構造情報から推定し、機能と構造との相関を詳細に解析することで、優れた酵素バイオセンサーの開発を目指す。
Causes of Carryover	平成３１年４月１日付で徳島大学へ転入し、研究の立ち上がりに時間が掛かったことが大きく、そのため消耗品や試薬類の購入が予定より減少した。また学外実験や学会発表においてもコロナウイルスの影響で取止めたことも影響している。結果として約２８万円の残額が生じた。しかし、環境整備については十分とは言えないもののおおむね終了しているため、令和二年度より研究を加速していくための研究資金として利用する。具体的にはタンパク質精製用機器類、酵素の機能分析用機器類の購入を検討している。特にタンパク質精製用機器は学部の共通機器として無いため、他大学へ赴き学外実験として行っている。コロナウイルスの影響で移動や出張が困難になることが予想される。自身の研究を遅滞させず、且つ加速させるための機器購入費として適切に運用する。