2018 Fiscal Year Research-status Report
新規微生物イメージング技術を用いた未培養微生物の可視化とシングルセル解析への挑戦
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18K14514
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| Research Institution | Matsue National College of Technology |
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Principal Investigator |
山口 剛士 松江工業高等専門学校, 環境・建設工学科, 講師 (30759832)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 視覚的検出 / 環境微生物 / Click chemistry |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、水圏に生息する環境微生物内の機能遺伝子をこれまで以上に簡便かつ高精度に検出できる視覚的検出技術を開発することを目的として、操作が容易な高感度fluorescence in situ hybridization (FISH) 法であるhybridization chain reaction (HCR)-FISH法とalkyne-azideの特異的な結合が可能なclick chemistryに着目した。まず、アナモックス細菌を特定的に検出できる機能遺伝子であるhzo遺伝子に着目し、hzo遺伝子を有した組換え微生物を作製した。次に、hzo遺伝子に交雑するプローブを作製するために、hzo遺伝子を検出できるプライマーとPCR-click 488 kitを用いてAlkyne付加プローブの作製を試みた。Alkyne修飾が最大になるようにマグネシウム濃度の変動させPCR法を行った。その後、電気泳動によりバンド長を確認した結果、PCRにおけるマグネシウム濃度が3.5mMの時、Alkyne修飾が最大であることが明らかとなった。最後に、hzo遺伝子を有した組換え微生物に対して、作製したAlkyne付加プローブ及びHCR-FISH法を適用させた。その結果、微弱であるが菌体から蛍光を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究により、Alkyne付加させるためにはプローブを作製するPCR法の際にマグネシウム濃度を3.5mM加えることで最大修飾量になることが明らかとなった。また、最終的に適用を試みる環境サンプルの微生物群集構造解析も行っている。しかしながら、コマモックス細菌やアナモックス細菌を特異的に検出できるプライマーを用いたPCR法では多くのスメアが得られたり、バンドが得られなかったりしたため未だ特異的なバンドが得られていない。 本研究の1年目の結果としては、hzo遺伝子を検出するプローブを設計し作製することを目的としているため、順調に進捗していると言える。さらに、来年度に向けて実験条件の最適化もすでに行っているため、着実に研究が進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、プローブを作製するPCR法の最適化は終わっている。また、多くのスメアが得られているがアナモックス細菌やコマモックス細菌のバンドが得られているため、2ステップPCR法等を行い特異的なバンドが得られるように最適条件を選定する。さらに、HCR-FISH法とclick chemistryを組み合わせた手法では、蛍光感度を向上させるために、プローブ濃度や反応時間などの実験条件の最適化を今後も進めていく予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度のおける新規手法の最適化を行う際の実験の効率化を行うために、超純水製造装置を購入する予定で進めている。また、最適化に向けて消耗品が多く必要となり、消耗品の購入が必要となるため次年度使用額として計上した。
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