2019 Fiscal Year Research-status Report
新規微生物イメージング技術を用いた未培養微生物の可視化とシングルセル解析への挑戦
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18K14514
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| Research Institution | Matsue National College of Technology |
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Principal Investigator |
山口 剛士 松江工業高等専門学校, 環境・建設工学科, 准教授 (30759832)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | comammox / 視覚的検出 / click chemistry |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、hybridization chain reaction (HCR)-FISH法とalkyne-azideの特異的な結合が可能なclick chemistryを用いて、アナモックスのhzo遺伝子の視覚的検出を行った。さらに、環境サンプルとしてアナモックス細菌だけでなくコマモックス細菌にも適用することを考慮し、様々な環境から環境サンプルを採取し、コマモックス細菌のamoA遺伝子を標的とした同定を行った。
1.アナモックス細菌のhzo遺伝子の視覚化
前年度の結果から、本手法を用いてhzo遺伝子を有した組替え微生物から蛍光を得ることに成功している。本年度は、蛍光強度を増幅させるためにプローブ濃度に着目し、研究を行った。その結果、蛍光増幅に用いるプローブの濃度を10 μMとすることで組替え微生物から強い蛍光が得られた。次に、今後の微生物の回収を考慮し、解離が容易なメンブレンフィルターを用いて環境中のアナモックス細菌の検出行った。しかし、メンブレンフィルターを用いるとアナモックス細菌から得られる蛍光強度が微弱であった。
2.コマモックス細菌の同定
本手法をアナモックス細菌以外の微生物にも適用するために、コマモックス細菌の同定を行った。コマモックス細菌の同定にはコマモックス細菌が有しているamoA遺伝子を標的として行った。宍道湖、水田、河川、畑などからサンプルを採取しコマコックス細菌のamoA遺伝子に対してクローニング解析を行った結果、畑から採取したDNAからコマモックス細菌であるNitrospira nitrificansが有する cladeA のamoA遺伝子に近縁な塩基配列が得られた。したがって、本手法を適用できるコマモックス細菌が生息していることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の予定としては、本手法の確立及び標的微生物を選定することを計画していた。本年度の成果としては、hzo遺伝子を有した組換微生物を用いて蛍光増幅に用いるプローブ濃度を最適化することで蛍光強度が増幅し、微生物を特異的かつ視覚的に検出できることが明らかとなった。しかし、最終年度に行う微生物回収を考慮し、メンブレンフィルター上で本手法を適用すると蛍光強度が減少することが明らかとなった。従って、今後メンブレンフィルターにおける最適化が必要であるが、蛍光増幅時間を検討するなど検討項目は絞られている。また、標的微生物としているコマモックス細菌に関しても環境中のコマモックス細菌のamoA遺伝子の同定に成功している。従って、本最終年度に行う微生物回収に適用できる準備はすでに整っているため、順調に進捗していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の予定としては、メンブレンフィルター上における本手法の最適化を行い、微生物回収装置と組み合わせるための最適化を行う。その後、環境中のアナモックス細菌及びコマモックス細菌に対して本手法を適用させる。その際の蛍光強度を確認し、問題なければ回収装置を用いて検出した微生物を回収する。その後、ゲノム解析による回収した微生物の同定を行う。特異的な検出及び回収できるか評価し、回収技術の最適化を行う。最終的にはシングルセル解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由としては、新型コロナの影響で参加予定の学会が開催されておらず旅費が生じなかったことが原因である。また次年度に使用する目的としては、新型コロナの影響で学会参加が減少すると考えられるので、研究を進める上で必要な回収装置や視覚的検出に用いる試薬に使用する。
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