Effect of imidazole compounds on the function of myosin

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K14563
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 早川 徹 北海道大学, 農学研究院, 助教 (20705173)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ミオシン / イミダゾール / 食肉

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、イミダゾール化合物の骨格筋タンパク質への作用について明らかにすることを目的とし、ヒスチジンによるミオシンの水溶化現象をモデルとして、ヒスチジンとミオシンとの相互作用の確認および相互作用によるミオシンの構造変化を確認する。
ミオシンはヒスチジンを含む低塩濃度条件下において溶解することが示されていたが、前年度までにミオシンの溶解度が金属イオンの濃度依存的に著しく低下することがわかっていた。当該年度の検討により、ヒスチジンを含む場合においても金属イオン存在下では、ミオシンは重合体を形成していることが電子顕微鏡を用いた観察により明らかになった。また、この溶解度の低下は正に荷電するアミノ酸の添加によっても生じることがわかり、この場合もやはりミオシンは重合体を形成していた。つまり、これらの化合物はヒスチジンとの親和力が高く、ヒスチジン-ミオシン間の相互作用を阻害することができると考えられる。ヒスチジンによるミオシンの水溶化現象を阻害するアミノ酸の属性を把握することができたため、ヒスチジンのミオシンにおける作用部位の特定に有益な情報を得ることができた。
また、予備的な検討として、ミオシンの表面電荷を測定したところ、ヒスチジンの有無によってそれらの値に差があることが確認された。これは上記の結果とともに相互作用部位の特定に有益な情報である。
当該年度では、大腸菌を用いたタンパク質強制発現系によるミオシン尾部領域フラグメントを作製したが、構造解析に必要な量のタンパク質の確保には至らず、計画通りの進捗とはいかなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

大腸菌を用いたタンパク質強制発現系によりミオシン尾部領域と同じアミノ酸組成をもつフラグメントを作製し、これらの構造解析を実施する予定であったが、タンパク質精製時に夾雑物が含まれ、この除去と濃縮に時間を要した。そのために構造解析に至っていない。
尚、夾雑物除去と濃縮の手法は概ね確立できたため、次年度は構造解析に取り組める予定である。

Strategy for Future Research Activity

タンパク質の精製に不具合があり遅れが生じていたが、解決策が見つかり、次年度は計画通りに進捗できる予定である。
ミオシンの水溶化を阻害できるアミノ酸の属性が概ね把握できたため、この情報をもとにヒスチジン-ミオシン間の相互作用部位を特定する。これには表面プラズモン共鳴法による分子間相互作用解析を用いる。また、ミオシン尾部を模したタンパク質フラグメントの精製も可能になったため、ヒスチジン存在下における構造の変化について解析に着手する。これは、CDスペクトル測定による二次構造の変化、およびゼータ電位測定による表面電荷の変化について検討する。

Causes of Carryover

前年に購入予定であった恒温振とう機の購入を見送ったことと、当該年度に参加予定であった学会が新型コロナウイルス感染拡大防止を理由に開催が中止となり旅費の支出がなくなったことが主な理由である。そのほか、消耗品などの節約に努めた。
次年度は、進捗の遅れを取り戻すために、有償の学内共有機器を利用し、繰り越した分を有効に活用する。