a basic study of peptide vaccine treatment using canine Survivin antigen

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K14584
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 山下 真路 鳥取大学, 農学部, 特命助教 (60813409)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: イヌ / survivin / がんワクチン

Outline of Annual Research Achievements

これまでにイヌの腫瘍細胞及び、自然発症癌の腫瘍組織におけるSurvivinの遺伝子発現を確認している。さらにイヌのペプチドワクチン開発に向けて、遺伝子の サブクローニング及び、DNAシークエンス技術を用いて、イヌのMHCclassIのDLA-88遺伝子のハプロタイプを判別する手技を確立した。TOPOクローニングキット を用いてcDNAからDLA-88遺伝子をサブクローニングし、DNAシークエンスにて塩基配列を解析した。その結果、実験に供するビーグル犬9頭のうち、5頭がDLA-88 novel41のホモであることを確認し、その他の3頭は novel41とその他のハプロタイプのヘテロであり、novel41を有していない犬は1頭のみであった。
さらに、アミノ酸配列決定に必要な技術であるELISpot assayの実験系の条件の検討を行った。ELISpot assayを用いて、survivinのアミノ酸配列中のDLA-88 novel41におけるエピトープを確認することが、本実験の目的であるが、イヌの癌抗原を用いたELISpot assayの報告はこれまで行われていない。そのため ELISpot assayの実験系を設定することが必要である。実験に供しているイヌは法律に則り、狂犬病ワクチンの投与が行われているため、狂犬病をポジティブコ ントロールにすることが適当と考えられた。
PMA・Inomycin感作をポジティブコントロールとし、狂犬病ワクチンを分離した犬のリンパ球に感作させ、ELISpot assayにてリンパ球の活性化を感知する実験の条件検討を行い、安定的にスポットを形成させることに成功した。
現在は、タンパク質を感作させ増殖させたリンパ球を磁気ビーズを用いて分離し、純粋なCD8+Tリンパ球による活性化を捉えるために条件を検討中である。