2018 Fiscal Year Research-status Report
CD103+樹状細胞の腫瘍局在促進による抗腫瘍免疫増強
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18K14598
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| Research Institution | Osaka Ohtani University |
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Principal Investigator |
守屋 大樹 大阪大谷大学, 薬学部, 助教 (30759759)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | CD103+樹状細胞 / Fucciマウス / KikGRマウス / 腫瘍免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腫瘍浸潤CD103+樹状細胞の中には、リンパ節に移行し、抗原提示により細胞傷害性T 細胞(CTL)を誘導する細胞に加え、腫瘍に留まりCTLに抗原提示をする細胞も存在することが示唆されている。 本研究は(1)腫瘍に「留まる」細胞が利用する分子メカニズムを解明し、(2)留まる分子を利用したCD103+樹状細胞の腫瘍局在促進により抗腫瘍CTLへの抗原提示促進を試みる。2018年度は(1)に関して、腫瘍に「留まる」CD103+樹状細胞の単細胞遺伝子発現解析のための準備を、(2)に関して、抗腫瘍CTLへの抗原提示の検出方法の確立を行った。
（１）腫瘍に「留まる」CD103+樹状細胞が利用する分子メカニズム解明のため申請者の所属機関外にて網羅的遺伝子発現解析を行う予定であったが、申請者の所属機関に新たにシングルセル解析システム（BD Rhapsody）の導入が決定し所属機関での実施が可能となった。このためBD Rhapsodyでの解析のための細胞分画の決定等の条件設定を行った。
（２）S/G2/M期の細胞がmAzami-Green(mAG), G1期の細胞がmKusabira-Orange2蛍光タンパク質を発現し細胞周期を可視化解析可能なFucciマウスを用い、本研究で用いている腫瘍のモデル抗原である卵白アルブミン(OVA)に対する抗原特異的CD8+T細胞をOVAテトラマー陽性細胞にて同定、フローサイトメトリー法により解析を行った。すると腫瘍組織内OVA抗原特異的CD8+T細胞の一部においてmAG+の増殖期の細胞を検出することができた。この方法を用い、CD103+樹状細胞の腫瘍局在増強時の抗原提示増強の有無について定量解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
腫瘍に「留まる」CD103+樹状細胞が腫瘍への局在に利用する分子について最初に解析する予定であり、当初は遺伝子発現解析を申請者の所属機関外にて行う予定であった。しかし申請者所属機関にシングルセル解析システム（BD Rhapsody）の導入が決定し所属機関での実施が可能となった。このため、予定を変更して先に腫瘍組織内での抗腫瘍CTLへの抗原提示の解析方法の確立を行った。遺伝子発現解析に関して、現在までに解析に使用する細胞分画の選出、および解析プロトコルの確認等についてはほぼ完了している。そして2019年度前半にはBD Rhapsodyを用いて遺伝子発現解析を行う予定である。（２）抗腫瘍CTLへの抗原提示の解析に関して、上述の通り解析方法は確立できており（１）の局在に利用する分子の同定、局在促進の検討の完了次第、迅速に解析が可能となったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）に関して、進捗状況に記載の通りBD Rhapsodyによる遺伝子発現解析の準備はほぼ完了しており、2019年度前期には実施する予定である。紫光照射により緑(KikGR-Green)から赤(KikGR-Red)に変換する光変換タンパク質KikGRを全身、あるいは樹状細胞特異的に発現するマウスに形成した腫瘍塊に光照射を行い腫瘍に浸潤している細胞を赤にマークする。一定時間後、腫瘍内KikGR-Red CD103+樹状細胞を「腫瘍に留まった細胞」、腫瘍内KikGR-Green CD103+樹状細胞を「腫瘍に新たに浸潤した細胞」細胞、所属リンパ節内のKikGR-Red CD103+樹状細胞を「所属リンパ節に移行した細胞」として分画に分けた後、遺伝子発現比較解析を行い、「腫瘍に留まった細胞」で遺伝子の高発現が認められたケモカインあるいはインテグリン分子を選出する。そしてフローサイトメトリー法により選出した分子のタンパク質発現解析を行う。腫瘍内KikGR-Red CD103+樹状細胞にタンパク質レベルで高発現の認められた分子に対して、中和抗体やアンタゴニストによるブロッキングを試み、局在阻害を指標に腫瘍内で局在する分子の同定を行う。
（２）について、前駆細胞からCD103+樹状細胞分化誘導した後、同定した局在に使用する分子を発現する細胞を分取、抗原であるOVAを付与した後に腫瘍内に移入する。2018年度確立した方法により抗腫瘍CTLへの抗原提示の解析を行い、抗原提示増強の有無について解析する。
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| Causes of Carryover |
予定していた遺伝子発現解析の実施を次年度実施に変更したため
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