2018 Fiscal Year Research-status Report
マウスES細胞の神経分化抵抗性に関与する新規遺伝子の機能解析
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18K14615
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
吉田 純子 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (30769196)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 神経分化異常 / zinc finger protein / 順遺伝学 / 神経デフォルトモデル / 分化抵抗性 / ES細胞 / adult neurogenesis / 大脳層構造異常 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、変異に伴いマウスES細胞の分化に異常をきたす機能未知のzinc finger protein（Zfp）遺伝子を同定し、その機能解析を進めている。
平成30年度は、本Zfp遺伝子の「培養細胞レベルでの分子メカニズムの解明」と「マウス胎児個体での機能解析」を目指して、前者ではChIP-seq、RNA-seq、質量分析を予定、後者ではホモ変異マウスの全身および脳の表現型解析を行うことを計画していた。
前者の「培養細胞レベルでの分子メカニズムの解明」については、ChIP-seq以外は全て予定通り進行し、現在、情報学的解析を進めている最中である。質量分析の結果では、NuRD複合体を形成する分子群との相互作用が認められた。NuRD複合体はES細胞の分化の際に重要な機能を果たす分子であることが知られており、この複合体とZfp遺伝子が相互作用するのであれば、神経分化時における未知の分子メカニズムが同定されたことになる。また、RNA-seqでは、Zfp遺伝子と共に発現量が変動する遺伝子群を解析したところ、大脳の発生に必要なことが知られている遺伝子や、神経疾患の原因遺伝子の可能性が示唆されている遺伝子などが同定された。ChIP-seqに関しては、当初はFlag tagでChIP-seqを行う予定にしていたが、より適切なtagへの変更などを行っていたため、予定より少々遅れて進行しているが、順調に前進している。
後者の「マウス胎児個体での機能解析」については、18.5日胚のホモ変異マウスの全身（脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、胸腺、腎臓、腸管）と胎盤の組織染色を行い、生まれた直後（１日以内）に死亡する原因を探索することを試みたが、野生型マウスと比較して特に変化が見られず、残念ながら死因を特定するには至らなかった。脳の組織染色を行った結果、大脳の６層構造に異常が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は、新規zinc finger protein（Zfp）遺伝子の「培養細胞レベルでの分子メカニズムの解明」と「マウス胎児個体での機能解析」を目指して、前者ではChIP-seq、RNA-seq、質量分析を予定、後者ではホモ変異マウスの全身および脳の表現型解析を行うことを計画していた。前者の項目の一つであるChIP-seqが未だ解析できていない段階であるが、その他は予定通り進行しており、ChIP-seq解析も適切なtagの検討などを行い、試行錯誤しながらも順調なペースで前進しているため、「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、質量分析で得られた結果（NuRD複合体とZfp遺伝子が相互作用すること）を共免疫沈降などで実験的に検証していく。相互作用が認められたら、NuRD複合体を形成する分子のノックアウト株を作製し、Zfp遺伝子のノックアウト株の表現型と比較する。
RNA-seq解析で得られた、Zfp遺伝子と共に発現量が変動する遺伝子群については、これらがZfp遺伝子と同じパスウェイに存在するか否かを検証するために、こちらについてもノックアウト株を作製し、Zfp遺伝子のノックアウト株の表現型と比較する。
ChIP-seqに関しては、CRISPR/Cas9を用いてZfp遺伝子座へtagをノックインし、ChIPの条件検討を早期に行い、ChIP-seq解析を行う。
また、科研申請書の当初の計画では、ヒトにおけるZfp遺伝子の機能解析を行うことを目的として、平成31年度より、ヒトiPS細胞でのZfp遺伝子のノックアウト株の作製を開始する予定にしていた。こちらについても予定通り開始する予定である。
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| Causes of Carryover |
ChIP-seq解析を行うにあたり、Zfp遺伝子に付加するtag配列を検討した。その過程において、当初予定していたtagと異なる配列を付加することになり、ChIP-seq実験が次年度に持ち越された。
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