マウスES細胞の神経分化抵抗性に関与する新規遺伝子の機能解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K14615
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 吉田 純子 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (30769196)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 神経分化異常 / zinc finger protein / １細胞解析 / 神経デフォルトモデル / 分化抵抗性 / ES細胞 / adult neurogenesis / 順遺伝学

Outline of Annual Research Achievements

申請者は、変異に伴いマウスES細胞の分化に異常をきたす機能未知のzinc finger protein（Zfp）遺伝子を同定し、その機能解析を進めている。
令和２年度は、本Zfp遺伝子の培養細胞レベルでの分化制御メカニズムの解明を目指して、質量分析により同定した本Zfp遺伝子産物と相互作用する分子の解析を進めた。その結果、破壊することで本Zfp遺伝子変異の表現型をさらに増強させる別のZfp遺伝子を同定することができた。これより、これら２つのZfp遺伝子が機能的な複合体を形成している可能性が示唆された。
また今年度は、本Zfp遺伝子変異体の神経分化誘導時における遺伝子発現制御ネットワークを同定するために、1細胞RNA-seqと1細胞ATAC-seqを行った。既にZfp遺伝子破壊株のみに現れる分化細胞集団の特定に成功しているが、今後は1細胞RNA-seqとATAC-seqの統合解析により、本Zfp遺伝子が関与する遺伝子制御ネットワークを同定したいと考えている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度は、１細胞RNA-seqの情報解析に注力した。その過程で、転写因子の解析が必要と考えられたことから１細胞ATAC-seqを行ったが、分化細胞のサンプル調製の実験条件の設定が困難であったことと、新型コロナウイルスに関連した研究体制の制限が重なったため、当初の予定以上の時間を要した。そのため、当初の計画では、令和2年度に「マウス胎児個体での機能解析」と「ヒトのホモログの機能解析」を目指して、前者では本Zfp遺伝子が発現しているマウスの組織での解析、後者ではヒトホモログを破壊したヒトiPS細胞での解析を予定していたが、これらについては、本Zfp遺伝子座に蛍光タンパク質をノックインしたマウスを作製し、ヒトiPS細胞でヒトホモログを破壊するためのtargeting vectorを作製した、に止まっている。

Strategy for Future Research Activity

今後は1細胞RNA-seqとATAC-seqの統合解析により、本Zfp遺伝子が関与する遺伝子制御ネットワークを同定したいと考えている。
また、本Zfp遺伝子が発現制御している標的遺伝子を探索すべく、ChIP-seq実験の準備もすすめていきたい。
本Zfp遺伝子座に蛍光タンパク質をノックインしたマウスについては、今後特にこのマウスの脳における遺伝子発現について詳細に解析し、機能を推定していく予定である。
ヒトiPS細胞での遺伝子ホモログのノックアウト株作製の準備もすすめているので、神経分化誘導時の経時的遺伝子発現の推移を調べ、マウスでの遺伝子ネットワークと比較することで機能解析をすすめていきたい。

Causes of Carryover

1細胞RNA-seqとATAC-seqという２つの解析が予想以上に時間がかかったため、今年度予定していた、①ChIP-seq実験、②本Zfp遺伝子座に蛍光タンパク質をノックインしたマウスの組織解析、③ヒトiPS細胞での遺伝子ホモログのノックアウト株の表現型解析が遅れた。そこで、次年度に①②③の実験を行う必要があるため、繰越することとした。