2018 Fiscal Year Research-status Report
ナノディスクを用いた免疫受容体Mincleのコレステロール認識機構の解明
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18K14633
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
古川 敦 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (30727699)
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2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 脂質 / 免疫受容体 / NMR / 相互作用解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. Mincleタンパク質およびコレステロールを含むナノディスクの調製
これまでにほぼ帰属が完了しているMacrophage inducible C-type lectin (Mincle)タンパク質については、これまでと同様の手法で高濃度に調製することに成功した。滴定に用いるコレステロールを含むナノディスクの調製も並行して行った。ナノディスクに用いるmembrane scaffold prortein(MSP)については、滴定に多くの量を必要とするため調製に困難を要したが、発現条件の検討により収量の改善を行った。また、ナノディスク作製に必要なコレステロールを含むリポソームの作製も行った。調製したリポソームとMSPを用いて、コレステロールを含むナノディスクの調製を行い、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、精製を行った。
2. コレステロールを含むナノディスクのMincleタンパク質への滴定実験
大阪大学蛋白質研究所が所有する950 MHz NMRを用いてナノディスクのMincleタンパク質への測定実験を行った。測定には、1H-15N Heteronuclear Single Quantum Correlation (HSQC)法を用いた。その結果、Mincleに対しナノディスク を３等量まで滴定を行ったが、滴定に伴い若干の化学シフト変化が見られたものの、その変化は小さいものであった。またその変化を濃度に対してプロットした結果、相互作用としては非常に弱いものであることがわかった。また、これまでに示唆されている結合に関わると示唆されたコレスロール結合モチーフのアミノ酸残基に着目したが有意なシフトは観測されていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NMR測定に適したMincleタンパク質の高純度な調製およびコレステロールを含むナノディスクの調製に成功した。さらに、本研究課題の目的であるMincleタンパク質へのナノディスクの滴定実験を予定通り進むことができたため、実験は概ね順調に進展している。一方で、滴定実験によるMincleタンパク質の化学シフトの大きな変化は見られなかった。このことは、通常量のコレステロールを含むナノディスクでは相互作用は弱い、もしくはほぼないことを示唆する結果であることが示唆された。このことは、不必要なMincleによる免疫活性化が通常状態では起こらないことを示唆する。そのため、病態を真似たより高密度にコレステロールを含むナノディスクを調製し、滴定実験を行う必要とする結果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
滴定実験により、Mincleタンパク質の化学シフトの大きな変化は見られなかった。このことは、通常量のコレステロールを含むナノディスクでは相互作用は弱い、もしくはほぼないことを示唆する結果であり、病態を真似たより高密度にコレステロールを含むナノディスクを調製する必要とする結果をえた。またコレステロールは、脂質ラフトに局在していることが示唆されているため、脂質ラフトに多く含まれるとされるスフィンゴ脂質やコレステロールの含有量の多いナノディスクも作製も試みる。
さらに、Mincleは結核菌表面に存在するトレハロースジマイコレート(TDM)を認識するが、その詳細な認識機構もわかっていない。そのため、ナノディスクにTDM類似体を埋め込み、滴定実験を行う。これによりMincleのコレステロール認識機構に加え、糖脂質認識機構の解明も行う予定である。
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| Causes of Carryover |
平成30年度は、ナノディスクの作製に必要なリン脂質が所属研究室にあったため、購入する必要がなくなったため。
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