2019 Fiscal Year Research-status Report
The elucidation of reaction mechanism of cytochrome c oxidase using XFEL time-resolved structure analysis
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18K14635
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
島田 敦広 岐阜大学, 応用生物科学部, 助教 (80723874)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 / 電子伝達 / 中間体構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チトクロム酸化酵素（CcO）はミトコンドリア内膜に存在する呼吸鎖末端酸化酵素で、酸素を水にまで還元して得られる自由エネルギーを利用して、プロトンをミトコンドリアマトリクスから内膜外へとポンプする。生命活動に利用されるATPの大部分はCcOとCcOへ電子供与するプロトンポンプ複合体とによって形成されたプロトン駆動力を利用して合成されており、本酵素はエネルギー変換の中枢を担うタンパク質である。CcOによる反応の詳細な理解のために、その反応中間体の原子構造をX線結晶構造解析によって得る試みがなされてきた。しかし、CcOの反応サイクルは非常に早く、酸素を水へと完全還元するのに数マイクロ秒程度しかかからない。従来のX線では高分解能の3次元構造を得るために数秒間X線を照射することが必要なため、短寿命の反応中間体構造を撮影することが非常に困難であった。そこで、本研究課題では、従来のX線よりも10億倍の強度と約1000分の1のパルス幅を持つX線自由電子レーザー(XFEL)を利用することで、これまで不可能であったCcOの非凍結結晶を用いた時分割構造解析を行い、短寿命中間体構造の解明を目指す。これまで、XFEL照射施設であるSACLAを利用して、CcOの中間体構造データの収集を行なってきた。現在は3.5 オングストローム分解能程度の回折データが得られている。アミノ酸側鎖のプロトン化状態を評価するためには、より高分解能のデータ収集が必要である。そこで、現在はさらに高分解能の結晶が得られるよう、精製・結晶化条件の検討を行い、SPring-8での予備実験によって、2.5 オングストローム分解能程度の回折データが得られる微結晶の調製に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シトクロム酸化酵素（CcO）の短寿命反応中間体構造を明らかにするため、光照射によって酸素を発生させるケージド酸素化合物とCcO微結晶を用いたポンプ-プローブ実験を行なった。すでにケージド酸素化合物の合成には成功し、さらに、長辺が100マイクロメートルほどの微結晶を安定に生産することにも成功している。現在は精製時の温度管理やプロトコルの見直しによって、さらに精製標品の質が向上し、凍結状態で2.5 オングストローム分解能程度の回折データが得られる微結晶を安定して供給する環境が整った。ケージド酸素化合物を浸透させた状態のCcO微結晶を用い、ケージド酸素化合物から酸素を放出させるための光照射100ナノ秒後にXFELを照射することで、酸素結合100ナノ秒後のCcO構造を決定することができる。しかし、得られた構造からは複数の中間体構造が混ざった状態であることが示唆され、これら混ざりを正確に評価し分離して別々に構造決定することが必要である。現在、これらの構造の混ざり具合を評価するための解析を進めると同時に、さらなる高分解能データの収集のため、精製・結晶化の改良やデータ収集装置の改良に取り組んでいる。また、過酸化水素によって処理したCcOの中間体構造の高分解能データ収集にも取り組んでいる。これによって、SACLAでのデータ解析時にリファレンスとなる中間体構造の利用が可能となり、より正確な構造決定が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画は若干の修正があるものの順調に推移しているので、このまま計画通りSACLAを利用して時分割構造データの収集、解析を行う予定である。CcOの詳細な反応機構を議論するには分解能は高ければ高いほど良いので、2.5 オングストロームの分解能を超えるさらに良質な微結晶の調製も引き続き行う。また、CcOの微結晶サンプルをXFELでの測定に供するまで安定に準備するための装置類（低温嫌気チャンバー）もさらに改良を加える予定である。CcOの生理学的な基質である酸素を利用した中間体構造の解明は非常に難易度が高くチャレンジングな研究である。そこで、SACLAを用いた時分割構造解析と並行して、安定な（擬似）中間体構造の決定も行っており、SPring-8でのデータ収集・解析を進行中である。また、CcOの酸素還元反応には、CcO中の金属原子からの酸素への電子の供給が非常に重要な役割を担っている。そこで、CcO中の金属原子の電荷も同時に測定中である。
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