2018 Fiscal Year Research-status Report
Structural and functional analyses of a core complex of the bacterial flagellar export gate complex
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18K14638
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
木下 実紀 大阪大学, 生命機能研究科, 特任研究員(常勤) (30790985)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 細菌 / 遺伝学 / 蛋白質 / 電子顕微鏡 / 感染症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、べん毛III型タンパク質輸送ゲートコア複合体の機能構造を原子レベルで理解するため、コア複合体を形成する相互作用ネットワークを遺伝学的および生化学的に解析するとともに、X線結晶構造解析法によりFliP, FliQ, FliRの構造を原子レベルで解明することを目指している。本年度の主な成果は以下に示す。
1.FliP/FliQ/FliR輸送ゲート複合体は5分子のFliP, 1分子のFliQおよび４分子のFliQから構成されること、FliQおよびFliRはFliPと直接相互作用することが明らかとなった。さらに、輸送ゲート複合体がMSリングの中心孔に結合した状態で単離精製することに成功した。
2.FliQの細胞質ループに存在する高く保存されているアミノ酸残基をアラニンに置換したところ、Gly-32, Gln-39, Thr-42, Glu-46, Leu-49およびLys-54がFliQの機能発現に重要であることが判明した。さらに、べん毛タンパク質輸送機能が著しく低下したfliQ(T42A)変異体およびfliQ(L49A)変異体から復帰変異体を単離することに成功した。それらのサプレッサー変異がFlhAおよびFliPに存在することが明らかとなった。
3.FlhBがFliP/FliQ/FliR複合体に直接相互作用することが明らかとなった。さらに、べん毛構成タンパク質が輸送ゲート複合体に結合できた場合でも、FlhB(E230A)変異が存在すると、輸送ゲートコア複合体の中心孔が開かないことが示唆された。
4.FlhAの細胞質ドメインが閉じた構造から開いた構造に変化するしくみを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝学的および生化学的解析から、輸送ゲート複合体の相互作用ネットワークを概ね明らかにすることができた。しかしながら、X線結晶構造解析に適した結晶は未だ得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
解析に適した結晶化スクリーニングを進める一方で、クライオ電子顕微鏡を用いてMSリングの中心孔に結合した輸送ゲート複合体の構造解析を進める。
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| Causes of Carryover |
高額な消耗品を購入する必要がなったためである。次年度ではクライオ電子顕微鏡による構造解析を実施するため、高額なクライオ電子顕微鏡観察用グリッドや界面活性剤の購入にあてるとともに、老朽化したNanodrop超微量分光光度計の購入にあてる。
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[Journal Article] Structural insight into the substrate specificity switching mechanism of the type III protein export apparatus2019
Author(s)
Inoue Y, Ogawa Y, Kinoshita M, Terahara N, Shimada M, Kodera N, Ando T, Namba K, Kitao A, Imada K, Minamino T
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Journal Title
Structure
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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