2018 Fiscal Year Research-status Report
X線結晶構造解析によるミトコンドリアトランスロケータSAM複合体の構造基盤
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18K14640
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
竹田 弘法 京都産業大学, 総合生命科学部, 学振特別研究員 (80816588)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | SAM-Mdm10超複合体 / 出芽酵母による複合体タンパク質の大量精製 / クライオ電子顕微鏡解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリアが正常に生命活動を維持するには、ミトコンドリアタンパク質を正確にミトコンドリア内に配送しなければならない。この配送を担うのがトランスロケーターである。Soritng and assembly machinery(SAM)複合体は、ミトコンドリアβバレル型膜タンパク質を、ミトコンドリア外膜に挿入するトランスロケーターである。SAM複合体はβバレル膜タンパク質であるSam50と膜表在タンパク質であるSam35/Sam37により構成される。しかし、SAM 複合体がどのようにタンパク質と結合して膜に挿入するのか、構成タンパク質がどのように相互作用してその機能を発揮するのかなど、様々な課題があるのが現状である。そこで本研究では、各タンパク質のX戦結晶構造解析を行うこととした。
当初、Sam37の結晶化に成功したが、のちに精製したSam37が全く別のタンパク質であることや、各タンパク質を単独で精製することは困難であることがわかった。そこで、最も大きな構成単位である、αヘリカル膜タンパク質をミトコンドリア外膜に挿入する SAM-Mdm10 超複合体の精製と構造解析に切り替えることとした。
まず、SAM-Mdm10大量発現用変異酵母を大量培養し、単離ミトコンドリアを Digitonin により可溶化した。可溶化ミトコンドリアを用いて IgG 精製・ゲル濾過精製を行なった。その結果、1 L 培地から約200ugのSAM-Mmd10 超複合体を高純度で精製することに成功した。さらに、精製 SAM-Mdm10をナノディスクに再構成し、クライオ電子顕微鏡による構造解析を行なった結果、分解能 4.0 angstromで構造を決定することに至った。現時点ではクライオマップの強度が部分的に低いので、これを解決するため、Fab抗体を用いた分子量増加によるマップの向上を目指す予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究の当初の計画では、各Samタンパク質のX線結晶構造解析を行うことになっていた。しかし、研究を進めるにつれ、酵母から各Samタンパク質を単独で精製することは困難であることがわかった。そこで、これらを最小単位とした最も大きなタンパク質複合体であるSAM-Mdm10超複合体の精製に着手することになった。結果的に、SAM-Mdm10超複合体の大量精製とクライオ電子顕微鏡による構造決定に至っている。これにより、各Samタンパク質のそれぞれの構造と、加えてMdm10の構造、合計4つのタンパク質を一挙に明らかにしたことになる。そのため、当初の計画であるX線結晶構造解析では、これら４つのタンパク質を一つずつ明らかにしなければならなかったが、計画よりも著しく効率的に構造解析ができたと考えている。また、超複合体として構造を決定したことにより、それぞれのタンパク質間の空間配置や相互作用が明らかになり、どのようにSAM-Mdm10超複合体がαヘリカル膜タンパク質を挿入するのかといった作用機序を提唱できる可能性を見出すことができた。
本年度では、研究計画に盛り込んでいた、「各Samタンパク質のX線結晶構造解析」を完了するに至っている。また、SAM-Mdm10超複合体の構造が明らかになったことで、研究計画の一つである「光部位的架橋によるタンパク質間相互作用の解析」をスキップすることにもなった。
以上のことから、本年度における研究成果は、当初の計画以上に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
SAM複合体の本来の機能は、ミトコンドリア外膜にβバレル膜タンパク質を挿入することである。一方で、SM-Mmd10超複合体は、αヘリカル膜タンパク質を挿入する。SAM複合体にMdm10が結合することにより機能が大幅に切り替わることは、非常に興味深く、原核生物の外膜にもこのようなタンパク質複合体は未だ見つかっていない。おそらくSAM-Mdm10超複合体は、細胞共生によるミトコンドリアの獲得後、真核細胞において独自に進化した姿であると考えられる。そのため、SAM-Mdm10超複合体がどのようにαヘリカル膜タンパク質の挿入メカニズムを明らかにすることは重要な課題になると考えられる。今後は、得られた構造を基盤として、SAM-Mmd10超複合体の変異体を作成し、in vivo あるいは in vitro によるαヘリカル膜タンパク質を用いた機能解析を行う。
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| Causes of Carryover |
ターゲットタンパク質の構造決定にクライオ電子顕微鏡解析を利用していたが、当該年度中盤から使用料金が徴収されることになった。これに伴い、次年度使用額を使わざるを得なかった。すでに構造決定に至っているため、今後使用する頻度は大幅に少なくなると思われる。また、今後の研究計画では、機能解析を中心に行うため、次年度は次年度使用額を超えないと考えている。
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