2018 Fiscal Year Research-status Report
哺乳類オートファジーの始動を制御するULK複合体の分子基盤
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18K14641
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
鈴木 浩典 東邦大学, 薬学部, 講師 (20625694)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | オートファジー / 構造生物化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジーは真核生物に広く保存された細胞内分解系であり，細胞質やオルガネラをオートファゴソームと呼ばれる二重膜（隔離膜）で隔離したのち，リソソーム（出芽酵母の場合は液胞）と融合して内膜ごと分解する現象である。出芽酵母を用いた遺伝学的な実験から，約40種類のオートファジー関連（Atg）タンパク質が同定されている。これらの多くは高等真核生物においても保存される一方で，高等な生物に特有のAtgタンパク質や付加領域が存在し，酵母と高等真核生物とでオートファゴソーム形成過程が異なることが予想される。
本研究では，高等真核生物のオートファジー過程の最上流に位置するULK複合体の構造生物学的解析を行うことで，高等真核生物に固有のオートファゴソーム形成過程を明らかにすることを目的としている。
ULK複合体を構成する各因子ULK1，FIP200，Atg13，Atg101のサンプル調製と結晶化スクリーニングを実施した。FIP200について結晶の得られた一部の領域について構造解析を行った。ULK1のC末端側領域がAtg13の天然変性領域と相互作用することが明らかとなり，構造解析のためのサンプル調製の簡素化のために共発現系を構築した。あわせて，Atg101とAtg13についても共発現系の構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ULK複合体の構成因子であるULK1，FIP200，Atg13，Atg101のサンプル調製と結晶化を行った。FIP200は種々の発現コンストラクトを作成し，性状確認まで完了していたため，結晶化スクリーニングを試行した。しかし，一部の領域を除いて良質な結晶は得られていない。C末端側の一部の領域は初期構造の決定まで完了していたため精密化を進めた。当該領域は平行なcoiled-coil構造を有し，二量体を形成していた。ULK1については，C末端側領域がAtg13のC末端側天然変性領域（IDR）と相互作用することが明らかとなった。Atg13の領域の絞り込みを行うとともに，サンプル調製の簡素化のため共発現系の構築を行った。Atg13とAtg101はすでに全長体の発現系を確立していたが，Atg101がAtg13の安定化に寄与することと，サンプル調製の簡素化のため共発現系の構築を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
FIP200の結晶化はサンプル精製条件や結晶化条件の最適化を行う。結晶化が困難な場合には，T4Lysozymeを融合するなど，結晶化タグを活用する。FIP200はAtg13およびULK1と相互作用するが，それらの結合領域が明らかとなりつつあるため，さらなる領域の絞り込みと，2者または3者の複合体を調製し，結晶化を試行する。結晶が得られたらX線回折強度データの収集，位相の決定，構造解析を進める。適当な結晶が得られない場合には，生物種を変えてみる。
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