2019 Fiscal Year Research-status Report
二光子顕微鏡と光操作による単一神経・グリア回路網の活動伝播様式の可視化
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18K14659
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| Research Institution | Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
石井 宏和 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 特任助教 (70743409)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 二光子顕微鏡 / ライブイメージング / 神経・グリア回路網 / オータプス / 超解像 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き、オータプス初代培養標本をモデルに神経・グリア回路網における活動伝搬様式を時空間的に可視化・解析する新規イメージング手法の構築を行なった。これまでに多点走査型2光子顕微鏡を用いてオータプス初代培養標本における自発的な神経細胞内カルシウム濃度変動の伝搬様式をライブイメージングすることに成功している。本年度はさらに培養系や蛍光プローブ、そして顕微鏡システムの最適化を行い、オータプス初代培養標本における自発的な神経細胞及びアストロサイトの細胞内カルシウム濃度変動の伝搬様式を同時に3次元ライブイメージングすることに成功した。さらに、観察視野下の任意の一点を光照射して単一細胞を光刺激するため光学系及びプローブの検討を進めた。
一方、オータプス初代培養標本における活動伝搬様式をナノスケールから細胞スケールで階層的に可視化解析することを目的に、超解像2光子STED顕微鏡システムの構築・応用を進めた。その結果、通常の2光子顕微鏡に比べて約5倍高い70-nmの空間分解能を得ることに成功した。このとき同じ蛍光ビーズを50回、最低速で繰り返し観察しても蛍光輝度は顕著に減少しないことがわかった。これは生物試料観察に有利な特徴であり、実際に固定神経細胞の微細形態やプレシナプスタンパク質の局在を顕著な光退色なく100-nm以下の空間分解能で超解像観察することに成功した。本研究成果については原著論文にまとめ、Biomedical Optics Expressに投稿して受理された（Ishii et al., 2019）。さらに本顕微鏡システムを用いて、オータプス初代培養標本における活動伝搬様式を超解像ライブイメージングするための条件検討を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請研究の要となる顕微鏡システムの構築・最適化については、多点走査型2光子顕微鏡に加えて2光子STED顕微鏡の応用も可能となり、当初の計画以上に進展している。一方で、申請者が所属する研究室の移動に伴い、実験が一時中断した。これにより当初の予定よりもイメージングデータを取得することが困難となったが、これまでに構築・最適化した顕微鏡システムを用いてオータプス初代培養標本を観察すれば当初の研究目的を達成できる見込みが立ったため、総合的に判断して、概ね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
現所属への顕微鏡・実験系の移設・再構築は2019年度に概ね完了した。次年度はこれまでに構築した顕微鏡システムを多角的に利用し、オータプス初代培養標本の局所光刺激により特定の細胞を活性化させ、その活動が神経・グリア回路網を伝播する様式をナノスケールから細胞スケールで階層的にライブイメージング解析する。
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| Causes of Carryover |
研究室の移動に伴い実験が一時中断した。このため実験関連の消耗品の使用頻度が減ったため、研究期間を延長して次年度に繰り越した。次年度は細胞培養関係試薬、蛍光プローブなどの消耗品や、成果発表のための旅費として使用する予定である。
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