Establishing a non-invasive real-time Ca2+ imaging with optogenetics-induced muscle stimulation in skeletal myotubes using DMD patient-derived iPSC

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K14663
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 内村 智也 京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (50815222)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 骨格筋 / iPS細胞 / オプトジェネティクス / カルシウム

Outline of Annual Research Achievements

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)という病気においてはカルシウムの上昇が認められており、この上昇を阻害する事が薬効へと期待されている。しかしながら、現時点においてもそのカルシウム阻害の薬効評価はまだ未知数である。本研究の目的は、カルシウムプローブであるG.CaMPとオプトジェネティクスプローブのChR2を用いた、real-timeかつnon-invasiveな骨格筋刺激モデルの確立及びその技術のスクリーニングへの活用である。まず最初にDMD患者由来のiPS細胞にG.CaMPプローブを安定的に発現させた細胞を樹立した。そのiPS細胞を骨格筋へと分化させ、分化した細胞を蛍光顕微鏡下においてG.CaMPのシグナルを安定的に観測出来る系を構築した。その後同様に、オプトジェネティクスプローブのChR2を安定的に発現させた細胞を樹立した。G.CaMP観測と同様に蛍光顕微鏡下において、レーザの刺激に応答して骨格筋の収縮活動を観測する事に成功した。これらのことから、蛍光顕微鏡下においてreal-timeにかつnon-invasiveな状態での細胞内のカルシウムの動きだけでなく、骨格筋の収縮活動も観測する事が出来ると思われる。その後、G.CaMP及びChR2両方の遺伝子を安定的に発現するiPS細胞を樹立し、系の確立を今後は予定している。またそれらを用いて96-well plateでのスクリーニングの系の構築も進めていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

おおむね当初の計画通りに推移している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、同一細胞にG.CaMPプローブとChR2プローブ２つを安定的に発現しているiPS細胞を樹立し、以下の点を検証していく。（１）光刺激のみで骨格筋細胞の成熟か及び収縮活動を引き起こせる事が出来るか（２）光刺激によって実際にG.CaMPプローブの反応が観測出来るか。（１）に関しては、そもそも今までは電気刺激によって骨格筋細胞の成熟化及び収縮活動を引き起こしており、光刺激だけで収縮活動が引き起こせるかは我々のモデルではまた未知である。そのため、実際に光刺激だけで収縮活動を引き起こせるかどうかの検証実験が必要である。また（２）に関しては、real-timeにカルシウムの動きを観測する為に（１）と同様に光刺激でG.CaMPプローブの蛍光反応を観測出来るかとうかの実証実験が必要である。

Causes of Carryover

本年度は特に高額な機材等の購入を必要であったため、支出額が低額に収まった。翌年度以降に関しては、当初予定していた機材の購入等を見込んでいる為本年度より支出額が増える見込みである。