2019 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集による四肢再生特異的発現遺伝子の機能解析とツメガエル成体の再生能回復
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18K14723
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
川住 愛子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (80625484)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 四肢再生 / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / ゲノム編集 / トランスクリプトーム解析 / RNA-seq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①ネッタイツメガエルにおける遺伝子X1のゲノム編集F1個体(幼生)の四肢発生・再生を解析した。前年度に遺伝子X2のゲノム編集個体で得られた結果と同様、遺伝子X1のゲノム編集個体（幼生）において四肢再生異常が見られること（N=23, 異常率：39%）、また四肢発生には全く異常が見られないことを確認した。また、遺伝子X1とX2の両方に変異を持つゲノム編集個体を作製しようと試みたが、目的の個体を得ることはできなかった。
②熱ショック応答により遺伝子X2発現を誘導するTransgenicアフリカツメガエル個体(変態後の幼若個体)について後肢切断を行って再生させ、どの様な軟骨パターンをもつ器官が形成されるかを確認した。その結果、先端が2~3本に分岐した軟骨をもつ器官が再生することを確認した（N=21, 30%）。この結果は前年度に得られたX1を過剰発現させた場合の結果と同様であった。①と②の結果より、X1, X2は重複する機能をもつことが示唆された。
③遺伝子X1, またはX2を過剰発現させたTg個体の再生部位における形態形成遺伝子発現をリアルタイムPCRによって確認した。その結果、野生型と比べてHoxA13, HoxD13, Shhの発現が有意に上昇していることが明らかになった。一方、Fgf8,10, HoxA11の発現については野生型に比べて有意差が見られなかった。
④遺伝子X1, X2のゲノム編集個体（幼生）/過剰発現個体（変態後の幼若個体）の四肢再生部位における細胞増殖を解析するため、それぞれの後肢再生領域についてリン酸化ヒストンH3の免疫染色を行った（増殖細胞数の比較はまだ行っていない）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
妊娠・出産により産前産後休暇と育児休暇を取得したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
熱ショック応答によって遺伝子X2発現を誘導するTransgenicアフリカツメガエル個体(変態後の幼若個体)を用いて後肢切断を行って再生させ、再生部位で形態形成遺伝子がいつどの部位に発現するかをRNAscopeによって確認する。
遺伝子X1, X2のノックアウト個体（幼生）の四肢再生部位における形態形成遺伝子発現についても同様に発現パターンの解析を行う。
遺伝子X1, X2のゲノム編集個体（幼生）/過剰発現個体（変態後の幼若個体）の四肢再生部位におけるリン酸化ヒストンH3の免疫染色を引き続き行う。野生型に対する増殖細胞数の比較を行う。
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| Causes of Carryover |
妊娠・出産のため産前産後休暇と育児休暇（計６ヶ月）を取得したために次年度使用額が生じた。
次年度は遺伝子X1, X2のノックアウト個体（幼生）/過剰発現個体（変態後の幼若個体）の四肢再生部位における遺伝子発現を解析するため、RNAscopeによる遺伝子発現パターン解析を行う予定である。
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