2020 Fiscal Year Research-status Report
Extracellular ATP signaling and perception in plant
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18K14726
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| Research Institution | Kitami Institute of Technology |
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Principal Investigator |
蔭西 知子 北見工業大学, 工学部, 研究員 (20815633)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 細胞外ATP / 根 / エンドサイトーシス / 環境応答 / 免疫染色 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アデノシン三リン酸（ATP）はエネルギー物質としてだけでなく、神経伝達物質としての機能が知られる。植物の細胞外ATP受容体DORN1は哺乳類とは異なり、膜に存在するキナーゼ様受容体の一つであること、エンドサイトーシスによって細胞膜の局在が変化することがわかっているが、植物の細胞外ATPの働きとシグナリング経路および受容体DORN1の作用機序については謎が多い。興味深いことに、DORN1はレクチンキナーゼ様受容体LecKI.9ドメインを有することが知られており、LecKI.9は植物の細胞壁と細胞膜の接着に関わることが予想されている。また、細胞外ATPが植物の根の屈性を調節することから、植物の根の屈性へのDORN1の関与が考えられる。そこで、植物の細胞外ATP受容体DORN1の組織レベルにおける発現分布を確認するために、DORN1プロモーターGUSを導入したDORN1-GUSをアグロバクテリウム法により作成した。今後DORN1-GUSで、DORN1の発現パターン解析およびDORN1による根の屈性調節の詳細解明を行う。
さらに、細胞外ATPシグナリングの経路を解明するために、DORN1に蛍光タンパクを接続しライブイメージングでの細胞外ATPシグナリング経路のリアルタイム観察を目的とした。実験ではシロイヌナズナにレポーター遺伝子GFPを導入したDORN1-GFPの作成をアグロバクテリウム法で行った。今後DORN1-GFPを観察することで細胞外ATP受容体DORN1の細胞な局在とエンドサイトーシスをはじめとした膜輸送によるリアルタイムな挙動を明らかにする予定である。
また、植物細胞内においてネイティブなDORN1の局在を観察するためにシロイヌナズナの抗DORN1抗体を作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物の細胞外ATP受容体DORN1の組織レベルでの発現を確認するために、DORN1プロモーターGUSを導入したDORN1-GUSをアグロバクテリウム法で作成中である。さらに、細胞レベルでのライブイメージングによる細胞外ATPシグナリングの経路を解明するために、シロイヌナズナにレポーター遺伝子GFPを導入した、DORN1-GFPの作成をアグロバクテリウム法で行った。現時点でホモ変異体のT2世代が得られており、今後共焦点レーザー顕微鏡で植物のDORN1の局在及びその挙動を観察する予定である。
また、レポーター遺伝子の導入に頼らず、植物のネイティブなDORN1の局在を観察するためにシロイヌナズナの抗DORN1抗体を作成し、免疫染色によるDORN1局在の観察を計画した。実験ではまず、抗体の特異性を検討するため、作成した抗DORN1抗体をウェスタンブロッティングで確認した。その結果DORN1でない、非特異なバンドがいくつか観察されており、原因を解明中である。
ミクロトームを用いた植物切片作成にあたり、Pavlovic博士（パラツキー大学、オロモウツ）との共同研究を通して、オオムギの葉タンパク質を抗体免疫染色で観察するプロトコルを確立した。
DORN1受容体研究に加え、ストレスによって放出される細胞外ATPが植物側に与える影響を調べた。細胞外ATPを根に添加後、植物地上部から放出される揮発性物質のGC-MS分析を行った。葉から放出された揮発物質について、HS-SPME-GC/MS（ヘッドスペース・固相マイクロ抽出法）で得られた結果について解析中である。
さらに、ATPと同様に細胞外のシグナリング因子として機能しうる、低分子の炭化水素化合物が植物の根の生長や細胞内輸送や細胞骨格に与える影響を明らかにしており、現在論文のリバイズを行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
植物の細胞外ATP受容体DORN1の組織レベルでの発現を確認するために、アラビドプシスのDORN1プロモーター領域のみをクローニングし、GUSに結合した変異体を用いて、各種ストレス応答や屈性時の発現パターン解析を行う。
さらに、細胞レベルでのライブイメージングによる細胞外ATPシグナリングの経路を解明するために作成したDORN1-GFPを共焦点レーザー顕微鏡で観察し、DORN1の局在及びその挙動をライブイメージングで観察予定である。
また、レポーター遺伝子の導入に頼らず、植物のネイティブなDORN1の局在を観察するために作成したシロイヌナズナの抗DORN1抗体を利用し、免疫染色によるDORN1局在の観察を行う。
根への細胞外ATP添加による植物地上部のストレス応答を明らかにするために、害虫や病原菌応答において見られる葉からの揮発性分子の放出に着目してGC-MSによる検出を引き続き行う。これにより、細胞外ATPの環境応答における役割を明らかにすることが出来る。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの影響のため、共同研究の実施、共同研究先および学会への訪問が不可能となった。次年度は細胞の免疫染色に必要なミクロトームを購入予定であり、本研究テーマによる論文投稿費用、学会発表にも使用させて頂く計画である。
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