2021 Fiscal Year Research-status Report
Extracellular ATP signaling and perception in plant
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18K14726
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| Research Institution | Kitami Institute of Technology |
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Principal Investigator |
蔭西 知子 北見工業大学, 工学部, 研究員 (20815633)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | シロイヌナズナ / 細胞外ATP / 根の重力屈性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アデノシン三リン酸（ATP）はエネルギー物質としてだけでなく、神経伝達物質としての機能が知られる。植物の細胞外ATP受容体DORN1は哺乳類とは異なり、膜に存在するキナーゼ様受容体の一つであること、エンドサイトーシスによって細胞膜の局在が変化することがわかっているが、植物の細胞外ATPの働きとシグナリング経路および受容体DORN1の作用機序については謎が多い。また、細胞外ATPは、根の重力屈性のコントロールすることが知られ、DORN1は、植物の細胞壁と細胞膜の接着に関係することが予想されていることから、DORN1の屈性への関与を、形態と組織免疫学的に観察することを目的とした。
本年度では重力屈性刺激後のDORN1の組織レベルでの発現を確認することを目的にDORN1プロモーターにGUS（β-グルクロニダーゼ）を接続したものと、DORN1プロモーターにGFP（緑色蛍光タンパク質）を接続したシロイヌナズナ変異体を、アグロバクテリウム法で作成した。さらに、根に重力屈性を与えられた際の細胞の形態の変化を詳細に観察することを目的として凍結切片、および樹脂切片の手法に取り組んだ。ミクロトームを用いた植物切片作成にあたり、Pavlovic;博士（パラツキー大学、オロモウツ）との共同研究を通して、オオムギの葉タンパク質を抗体免疫染色で観察するプロトコルを確立した。
DORN1受容体研究に加え、ストレスによって放出される細胞外ATPが植物側に与える影響を調べた。細胞外ATPを根に添加後、植物地上部から放出される揮発性物質のGC-MS分析を行った。葉から放出された揮発物質について、HS-SPME-GC/MS（ヘッドスペース・固相マイクロ抽出法）で解析中である。
さらに、ATPと密接に関係する炭化水素化合物が植物の根の環境応答に与える影響を明らかにしており、現在投稿論文の修正を行っている段階である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
所属大学には共焦点レーザー走査顕微鏡の設備がなく、近隣の東京農業大学網走キャンパス保有機器の使用承諾を得ていた。しかし、コロナウィルス感染拡大によってキャンパスへの立ち入り制限などで研究が大幅に遅れた。そのため、計画していたシロイヌナズナにレポーター遺伝子GFPを導入した、DORN1-GFPの観察が滞っている状態である。そこで、ライブイメージングによるDORN1の観察に代わり、凍結ミクロトームを本年度導入した。凍結切片、および樹脂切片を作成したDORN1の観察法に切り替え、オオムギの葉タンパク質を抗体免疫染色で観察するプロトコルを確立した。この切片作成の手法は、細胞外ATPによる重力屈性の制御の際、植物の細胞壁－細胞膜の接着に関係することが予想されているDORN1の局在を組織免疫学的に観察することできる。引き続き、免疫染色の条件検討を行っている状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
GUSやGFPレポーター遺伝子とDORN1が接続した遺伝子を発現するシロイヌナズナ変異体を用い、根の重力屈性時の植物組織における発現パターンを共焦点レーザー走査顕微鏡による観察と、免疫組織染色法による観察・解析を引き続き行う予定である。また、植物で傷害応答による細胞外ATP放出の役割を明らかにするために、GC-MSによる害虫や病原菌応答において見られる葉からの揮発性分子の検出を行う。
細胞外ATPによる重力屈性の制御について、DORN1がどのように関わっているのか、その植物の細胞壁－細胞膜の接着の機能が関係するのかを明らかにし、最終年度である次年度は研究成果の学会発表および論文発表を予定している。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの影響のため、共同研究の実施、共同研究先および学会への訪問が不可能となった。次年度は本研究テーマによる論文投稿費用、学会発表にも使用させて頂く計画である。
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