2018 Fiscal Year Research-status Report
長期連合記憶におけるシナプス可塑性の電気生理学的解析とその分子メカニズムの解明
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18K14747
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
清水 一道 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (50808095)
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2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 記憶・学習 / 電気生理学 / ショウジョウバエ / シナプス可塑性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
記憶・学習の成立、およびそれによる行動の変化にはシナプス伝達効率の過疎的な変化が関わると広く考えられているが、特定のシナプスにおける可塑性がどのように記憶・学習成立後の行動変化に寄与するかは明らかになっていない。そこで本研究では、ショウジョウバエの匂い記憶において行動変化に直接関与すると考えられているキノコ体出力神経細胞（Mushroom Body Output Neurons, MBONs）とその下流の神経細胞であるDorsal-Anterior-Lateral Neurons（DALn）をつなぐシナプスにおける可塑性に着目した。具体的にはMBON-α3およびMBON-β’2mpとDALnとのシナプス結合、およびDALnの長期記憶への関与が示唆されているため、これらのシナプス前・後細胞から同時にパッチクランプ法を用いて細胞内電位を測定する。シナプス前細胞であるMBONの活動電位により誘導されるDALnの興奮性シナプス後電位（EPSP）の長期記憶形成による増強／抑圧を観察し、最終的にはシナプスの素量解析を行うことでシナプス可塑性の細胞学的機序を解明することを目標としている。
当該年度中は、パッチクランプ法による神経活動記録の標的とする細胞で特異的に蛍光マーカーを発現する系統を作製し、シナプス前・後細胞からそれぞれ単独での細胞内記録を行なった。シナプス後細胞であるDALnからのin vivo細胞内記録では、既に報告されている匂い刺激に対する抑制性の応答や自発発火が観察されている。一方、シナプス前細胞のMBON-β’2mpからのin vivo細胞内記録では興奮性の匂い応答が見られたが明瞭な活動電位は観察されなかった。本研究ではシナプス前細胞の単一活動電位に対するシナプス後細胞のEPSPの測定が必須となるため、今後はMBON-α3・DALn間のシナプスに着目して解析を進めていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、記憶・学習に伴う行動変化を担うシナプス可塑性を素量解析により明らかにすることを目指している。そのため、シナプス前細胞の単一活動電位により引き起こされるシナプス後電位の測定が不可欠である。当該年度中にシナプス後細胞であるDALnとシナプス前細胞の一つであるMBON-β’2mpからのin vivo細胞内記録を行なったが、MBON-β’2mpからは明瞭な活動電位が計測されなかった。この原因としては、細胞内で活動電位の受動拡散距離が長いことや、電極の抵抗と浮遊容量がローパスRCフィルターを形成し活動電位の高周波成分が検出できなくなっていることなどが考えられる。前者は細胞の内在的な性質であり改善は困難であると予想される。また後者に関しても、電極の浮遊容量が典型的なパッチクランプ電極の値であり、かつ増幅器による浮遊容量の補正も行なっていることから改善の余地は小さい。いずれにしても、当初の予定であったシナプス前・後細胞からの同時パッチクランプ記録による素量解析はMBON-β’2mp・DALn間のシナプスでは困難であることが判明した。そこで今後は、もう一つのシナプス前細胞であるMBON-α3からの細胞内記録を行い活動電位の検出可能性を検討する。活動電位が検出された場合にはDALnとの同時記録を行いMBON-α3の単一活動電位により誘導されるDALnのシナプス後電位を測定する。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述のようにMBON-β'2mp からは明瞭な活動電位が検出できずMBON-β’2mp・DALn間のシナプスでは素量解析が困難であると判明したので、今後はMBON-α3・DALn間のシナプスを解析対象とする。まずMBON-α3から明瞭な活動電位が計測可能か確認するが、MBON-α3の細胞体はin vivoパッチクランプには適さない位置にあるため単離脳を用いたex vivoパッチクランプを行う。細胞への電流注入またはチャネルロドプシンバリアントのCsChrimsonにより細胞を脱分極させて活動電位の発生を確認する。前者は簡便ではあるが注入した電流が活動電位発生部位まで有効に届かない可能性がある一方、後者は遺伝学的な操作が必要であるが活動電位発生部位を直接脱分極させることが出来る。MBON-α3の活動電位が確認された場合、MBON-α3とDALnの同時パッチクランプ記録をex vivoで行う。この際、上述のMBON-α3からの単独記録で活動電位を誘発できた手法を用い、MBON-α3の単一活動電位によるDALnのEPSPを測定する。細胞外液に様々な濃度の電位依存性カルシウムチャネル阻害剤を混合することでシナプスの放出確率を変化させ、それぞれの条件で得られるunitary EPSPの平均値と分散値をプロットする素量解析を行う。さらに、忌避性長期記憶を形成させた個体群に対しても同様の素量解析を行い、コントロール群との比較を行う。当研究室ではショウジョウバエに長期記憶を形成させるシステムが既に自動化されており、MBON-α3・DALnの素量解析が可能になれば速やかに長期記憶形成個体群とコントロール個体群の比較に移行できると期待される。
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| Causes of Carryover |
＜次年度使用額が生じた理由＞
当該年度に購入予定であった電気生理学関連機器が当研究室に既存の機器で代替可能であることが判明したため。
＜使用計画＞
MBON-α3の活動電位を誘導する必要が生じたため、光遺伝学実験に必要なLED照明一式を購入予定である。また、電気生理学実験に必要な神経細胞染色用トレーサーやその他関連試薬の購入に用いる。
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Research Products
(1 results)
