2020 Fiscal Year Research-status Report
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18K14835
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
新田 陽平 新潟大学, 脳研究所, 日本学術振興会特別研究員 (30800429)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ショウジョウバエ / 神経発生 / 脂質代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までの研究によって、リン脂質代謝回路の一翼を担うCDP-ジアシルグリセロール(CDP-DAG)合成酵素であるCdsAの機能欠失変異体ではキノコ体神経細胞のサブタイプの1つであるα’/β’ニューロンで軸索の断片化が誘導されることを見出し、同回路で下流に位置するホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸 (PI(4,5)P2)を減少させても同様の軸索断片化が確認された。更に、時期特異的なCdsAノックダウン実験を行い、発生中の特定の時期(蛹化後24時間前後)にのみCdsAをノックダウンすると軸索の断片化が生じることが明らかとなった。本年度では、CdsAの抗体の作成による発現組織の同定及びPI(4,5)P2の下流で機能する因子の網羅的スクリーニングを行った。
CdsAが発現する組織および細胞内局在を同定するため、CdsAのC末端付近をエピトープとしたラット抗体を作成した。この抗体がCdsAを正確に検出できることは、既報のCdsA過剰発現系統及びノックダウン系統を用いることによって確認した。この抗体を用いてキノコ体神経における局在を確認したところ、α’/β’ニューロンにおいてCdsAが強く発現していることが観察された。この結果は、α’/β’ニューロンで強い軸索断片化が観察されるという前年度までの結果と一致している。
また、PI(4,5)P2が関与する新規の軸索断片化機構を明らかにする為にPI(4,5)P2と結合するタンパク質を標的とした網羅的スクリーニングを行った。計258遺伝子を対象としたRNAiスクリーニングを行い、21遺伝子でCdsAやPI(4,5)P2合成酵素をノックダウンした時と同様の軸索断片化の表現型が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
PI(4,5)P2の可視化を予定していたが、新型コロナウイルスの影響で出張が困難となっており、遅れている。また、前年度までの研究でCdsAとカルパインAを同時にノックダウンすると軸索断片化が有意に抑制されることを見出したが、変異体や過剰発現を用いた解析によってカルパインAが無関係である可能性が強く示唆され、断片化の実行因子については未だに同定できていない。一方、PI(4,5)P2の下流候補については21遺伝子があがっており、分子機構の解明が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度でPI(4,5)P2の下流候補として見いだされた21遺伝子について変異体解析などを行い、PI(4,5)P2の現象が軸索断片化を引き起こすメカニズムを明らかにする。
また、CdsAのノックダウンによってPI(4,5)P2が減少する事をキノコ体神経でも確認するために引き続き共焦点ラマン顕微鏡等を用いて明らかにする。新型コロナウイルス禍が長引く場合やラマン顕微鏡による脂質の同定が上手く行かない場合はELISAなどを用いて組織レベルでPI(4,5)P2を定量する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの影響で出張が困難となり、PI(4,5)P2の可視化以降に予定していた実験が実施できなかったため次年度使用額が生じた。本年度でもラマン顕微鏡を用いたPI(4,5)P2の可視化を極力目指すが、出張が困難な場合は組織レベルでPI(4,5)P2の定量を目指す。
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