2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of cell penetrating peptides based on helical promoter for biomedical application
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18K14880
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
三澤 隆史 国立医薬品食品衛生研究所, 有機化学部, 主任研究官 (40709820)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヘリカルテンプレート / 細胞膜透過性ペプチド / クリックケミストリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
従来の小分子を基盤にした創薬では治療することが困難な難治性疾患が数多く存在している。その中でRNA干渉を誘導するsiRNAなどを利用した遺伝子治療が注目を集めている。しかし、核酸などの生体高分子は細胞膜を透過することができず、その治療効果を十分に発揮することはできない。オリゴアルギニン(Rn)に代表される膜透過性ペプチド(CPPs)は生体高分子などの親水性分子を細胞内に導入するキャリア分子として注目を集めている。しかし、生体内安定性や細胞選択性に乏しいなど生体応用を目指した場合、多くの問題点が残されている。本研究では、ペプチドの二次構造制御を基盤とした細胞膜高透過性ペプチドの開発を行う。その中で、オリゴアルギニンに対しヘリカルテンプレートペプチドをコンジュゲートすることで、細胞膜透過性を飛躍的に向上させることを見出した。さらに、ヘリカルテンプレート構造に対し、post-midificationを行うための足場としてアジド基を導入したペプチドをデザイン・合成した。合成したペプチドは、CDスペクトルを用いることで二次構造解析を行い、安定なヘリカル構造を形成していることを見出した。また、HeLa細胞やMCF-7細胞に対する細胞膜透過性をフローサイトメトリーにより評価した。これらのさらなる応用研究として、水溶性生体高分子である核酸の細胞内デリバリーを検討し、効率的に各種核酸のデリバリーに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞膜透過性ペプチドの二次構造制御を目的として、a,a-ジ置換アミノ酸を導入したヘリカルテンプレートペプチドのデザイン・合成をおこない、高い細胞膜透過性を示すペプチドの合成に成功した。また、テンプレートペプチドにpost-modification可能なアジド基を導入した新たなテンプレート細胞膜透過性ペプチドの開発を行なった。合成したペプチドの二次構造解析や細胞膜透過性評価を行い、研究計画の記載事項に沿う、新規細胞膜透過性ペプチドの創製に成功している。以上のことから、研究は順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
従来のCPPsは生体内安定性が乏しく、その実用化は困難であった。そこで、本研究ではアジド基を持つヘリカルプロモータ配列を足場として様々な官能基修飾を行うことで高い膜透過能を維持したまま生体内安定性の向上あるいは細胞選択性を付与することを目指す。まず、これまでに合成した膜透過ペプチドのヘリカルプロモータ配列上アジド基に対し、クリック反応を用いてPEG基を導入し、二次構造および膜透過能への影響を検討する。ヘリカル構造及び膜透過能を維持したペプチドに対し、トリプシンなどのペプチダーゼで処理後、HPLCを用いて半減期を算出することで安定性を評価する予定である。PEG基は血中滞留性を向上させる一方で、細胞内導入後の動態に不利に働くことが知られている。そこで、細胞内導入後にPEG基の脱離が好ましいが、クリック反応は不可逆的でありPEG基の脱離は困難である。このような場合に細胞内導入後の切断を目的として、光分解による脱離を考案しmAzNBLをデザイン・合成する。o-Nitrobenzyl基は光によって分解する保護基として利用されており、この性質を応用することでmAzNBLは細胞内に導入後光照射によってリジン残基に変換できると考えている
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| Causes of Carryover |
本年度は、ペプチド合成を行うための試薬や、縮合剤、溶媒等の消耗品に充てる予定であったが、これまでの試薬残分によって、予定よりも試薬購入が抑えられた。また、合成した合成が順調に進展したため、合成に関する消耗品購入が抑えられたと考えている、これらの差額分に関しては、今後のpost-modificatuionの試行例を増やすため、あるいは細胞系をしようした高次活性評価系の構築に充当される予定である。
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