2018 Fiscal Year Research-status Report
がん免疫の活性化を伴う新規プログラム細胞死機構の解明
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18K14893
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
鍛代 悠一 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (90756165)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | がん免疫 / 抗がん剤 / DAMPs / 自然免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究目的
本研究ではトポテカン誘導性細胞死における細胞死関連遺伝子を同定し、その細胞死機構を明らかにするとともに、同定した遺伝子の活性化が細胞死とそれに伴うがん免疫の誘導を介して腫瘍の成長を阻害するかを担がんマウスモデルを用いて評価する。
これまでの研究成果
申請者はトポテカンの既知の標的タンパクであるトポイソメラーゼIの欠損細胞をCas-CRISPR法を用いて作成し、トポテカンに対する耐性を検証した結果、トポイソメラーゼI欠損細胞においてもトポテカン誘導性細胞死は誘導されることが判明した。そこでトポテカンはトポイソメラーゼIとは異なる標的タンパクを介して細胞死を促進することが示唆されたため、申請者はトポテカン結合ビーズを作成して新規トポテカン標的タンパクの探索を行い、新規トポテカン標的遺伝子を質量分析により同定した。さらにこの新規トポテカン標的遺伝子の点変異体とトポテカン結合ビーズによるプルダウンアッセイを行った結果、トポテカンの結合に必要なアミノ酸を同定した。このトポテカンに結合しない変異体はトポテカンによるトポイソメラーゼI非依存的な細胞死とDAMPsの放出を抑制した。この新規トポテカン標的遺伝子をドキシサイクリン依存的にノクダウンするEG7細胞を作成済みであり、現在はこのEG7細胞をC57BL/6マウスに同系移植し、トポテカンによるがん免疫の活性化に新規トポテカン標的遺伝子が生体内において寄与しているかを検証中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究から、新規トポテカン標的遺伝子とトポテカンとの結合部位を同定し、タンパク構造情報から結合シュミレーションを行えたこと、また新規標的遺伝子がトポテカンによる細胞死やがん免疫の活性化に寄与していることを明らかにできたことから研究はおおむね順調に進捗していると考えられる。しかし、当初の仮説とは異なり、カルシウムシグナルと新規トポテカン標的遺伝子との間に有意な相関は見られなかった。そのためカルシウムシグナルとトポテカンによるがん免疫の活性化との関連を裏付けるデータは得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
生体内において新規トポテカン標的遺伝子の阻害が細胞死に伴うがん免疫の活性化に寄与するかを検証するため、Tet-ONシステムを利用してドキシサイクリン誘導的に同遺伝子がノックダウンされるEG7細胞を作成する。Tet-ONシステムはドキシサイクリン誘導性プロモーターを使用した遺伝子発現システムであり、RIPKなどのように遺伝子発現に伴い細胞死を誘導する遺伝子の解析に非常に効果的である。そこでTet-ONプロモーターと同定した遺伝子のshRNAをEG7細胞に組み込み、マウスに移植し、担がんマウスを作成する。EG7細胞はトリ卵白アルブミン（OVA）を恒常的に発現するマウス由来のリンパ腫細胞であり、EG7細胞を移植したマウスの体内ではOVA特異的な抗原提示が行われることが知られている。そこで上記の細胞をマウスに移植後、ドキシサイクリンを担がんマウスに投与し、がん細胞の細胞死を誘導した後にマウスから樹状細胞を回収する。この樹状細胞をOVA特異的なT細胞受容体を持つOT-I T細胞と共培養し、OT-I T細胞の増殖とサイトカイン産生を定量することでトポテカン誘導性細胞死実行遺伝子による細胞死ががん抗原特異的な細胞障害性T細胞の活性化を誘導し、がん免疫を増強するかを検証する。
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| Causes of Carryover |
日本薬学会 第139回年会への参加を取りやめたため未使用額が発生した。
生化学実験全般に必要な試薬・消耗品の購入に使用する。
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