2019 Fiscal Year Research-status Report
DNA methylated-regulation in neutrophil extracellular traps
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18K14909
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| Research Institution | Suzuka University of Medical Science |
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Principal Investigator |
安田 浩之 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助手 (40780284)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 好中球細胞外トラップ / DNAメチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、好中球細胞外トラップ（NETosis）の誘導メカニズムを明らかにするために、DNAメチル化制御に着目して検討を進めている。研究代表者は、DNAメチル化転移酵素（DNMT）の阻害剤である5-azacytidine（Aza）を用いて、好中球様細胞に分化させた骨髄性白血病細胞でのNETosis誘導変化について検討しており、前年度までにAzaはアルギニンをシトルリンに変換する酵素であるpeptidylarginine deiminase 4（PAD4）発現を亢進させ、NETosis誘導を亢進させているということを明らかにした。また、ELISAによって細胞内のDNAメチル化状態や、NETosisによって細胞外に放出されたDNAのメチル化状態を検討したところ、細胞内のゲノムDNAはほとんどメチル化しておらず、細胞外に放出されるDNAは全くメチル化していないことがわかった。さらに、好中球への分化によってDNAメチル化が亢進する傾向にあることがわかった。しかし、DNMT1の発現は分化によって有意に減少したことから、好中球分化によるDNAメチル化亢進とDNMT1発現減少は相関していないことがわかった。そこで、DNA脱メチル化機構の一つであるten-eleven translocation（TET）の発現とTETに媒介される中間生成物として5-hydroxymethyl cytosine（5hmC）の存在を確認したところ、分化によってTET1の発現が有意に減少し、5hmCも確認できたことから、好中球分化によるDNAメチル化亢進はTET1などによって誘導され、PAD4発現はDNMT1によるDNAメチル化制御よって調節されていることが示唆された。これらの結果によって、好中球分化によるDNAメチル化状態の変化は、その後に起こるNETosis誘導に影響を与える可能性があることを示せた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNMTを阻害するAzaだけではなく、TETを阻害すると言われているαヒドロキシグルタル酸（αHG）を用いて検討を行った。TETはTET1、TET2、TET3が存在するが、好中球分化によってTET1とTET3の発現が減少し、TET2の発現が亢進した。好中球様細胞にαHG を添加したところ5hmC量は減少したが、NETosisやPAD4の発現に影響がなかった。このことから、好中球分化にはTET1などの影響があると考えられるが、NETosisへはDNA脱メチル機構は関与しない可能性があることが示唆された。DNAメチル化制御に関与するDNMTとDNA脱メチル化制御に関与するTETという二方向からNETosisの誘導メカニズムを明らかにすることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNA脱メチル化によってNETosisが誘導され、PAD4の発現が亢進することがわかった。今後は、よりPAD4の影響がAza誘導性NETosisに関与するかどうかを明らかにするため、PAD4の阻害剤を用いて検討する。また、Aza誘導性NETosis NOX由来ROSの影響がないことはわかったが、NOX非依存的NETosisはミトコンドリアROSの影響を受けることが知られているため、mito-TEMPOなどのミトコンドリアROS阻害剤を用いてその影響を確認する。
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| Causes of Carryover |
研究成果に関する費用が予算額より下回ったため、次年度使用額が生じた。その費用を次年度の研究発表費用に充てる予定である。
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