日本脳炎ウイルスの感染に関わる宿主因子のゲノムワイド探索およびその機能解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K14912
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 佐久間 智理 国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (80782888)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 日本脳炎ウイルス / ゲノムワイドスクリーニング / 宿主因子

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、CRISPR/Cas9システムによる遺伝子ノックアウト系およびCRISPR/Cas9システムの変法である遺伝子発現活性化系を使用したゲノムワイドスクリーニングにより、遺伝子のノックアウトまたは過剰発現で日本脳炎ウイルスに耐性を示す宿主因子を同定することである。スクリーニングにより同定された遺伝子群について機能解析を行うことで、日本脳炎ウイルスの感染に関わる宿主因子の網羅的な同定および機能の解明を目指す。
昨年度には遺伝子ノックアウト系および遺伝子発現活性化系それぞれのsingle guide RNA (sgRNA)ライブラリー導入細胞群を作製した。本年度はこの細胞群を用いて、日本脳炎ウイルス感染による細胞死を指標としたゲノムワイドスクリーニングを行った。日本脳炎ウイルス感染による細胞死に耐性を示した細胞群からゲノムDNAを精製し、次世代シーケンサーを用いてどのようなsgRNAがゲノムに挿入されているか解析を行った。その結果、日本脳炎ウイルス感染なしのコントロールと比較して過剰に検出されたsgRNAが複数得られた。これらのsgRNAを日本脳炎ウイルスの感染に関わる宿主因子の候補とした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度までに遺伝子ノックアウト系スクリーニングに用いる親株にはFeng Chang研究室が作成したGeCKO v2.0ライブラリー(Science 343; 83-87(2014))を導入し、遺伝子発現活性化系スクリーニングに用いる親株にはFeng Chang研究室が作成したSAMライブラリー(Nature 517; 583-588 (2014))を導入してそれぞれのスクリーニング系のsgRNA導入細胞群を作製した。また、細胞密度やウイルス力価、感染スケジュール等の条件検討を行い、日本脳炎ウイルス耐性遺伝子のスクリーニングに適したプロトコルを作成した。本年度は。このプロトコルに沿ってゲノムワイドな遺伝子ノックアウトおよび発現活性化細胞群に日本脳炎ウイルスを感染させ、ウイルス感染による細胞死に耐性を示した細胞群を回収した。回収した細胞群からゲノムDNAを精製し、ゲノムに挿入されたsgRNAをPCRにより増幅し、次世代シーケンサーを用いて解読した。日本脳炎ウイルス感染なしのコントロールも同時に解析を行い、コントロールよりも過剰に検出されたsgRNAを日本脳炎ウイルスの感染に関わる遺伝子の候補とした。なお、この解析は国立感染症研究所病原体ゲノム解析研究センターとの共同研究により行った。

Strategy for Future Research Activity

日本脳炎ウイルスのライフサイクルに必要とされる宿主因子および同ウイルスの感染に抵抗性を示す抗ウイルス作用をもった宿主因子の候補が複数得られた。オフターゲット作用による細胞死への耐性ではないことを確認するために、候補遺伝子についてCISPR/CAS9システムによる遺伝子ノックアウトのためのsgRNAの設計およびcDNAのクローニング行う。このsgRNAとcDNAを用いてノックアウト細胞および目的のcDNAを過剰発現する細胞株を樹立し、細胞の生存率を指標として日本脳炎ウイルスへの耐性を評価する。

Causes of Carryover

次世代シーケンサーによる解析を行うサンプルをまとめることにより、解析の回数を削減することができ、当初の購入予定よりも少ない試薬でスクリーニングが完了したため。