日本脳炎ウイルスの感染に関わる宿主因子のゲノムワイド探索およびその機能解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K14912
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 佐久間 智理 国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (80782888)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 日本脳炎ウイルス / ゲノムワイドスクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではCRISPR/Cas9システムによる遺伝子ノックアウト系およびCRISPR/dCas Activationシステムによる遺伝子発現活性化系を用いて、遺伝子ノックアウトまたは発現活性化により日本脳炎ウイルスが引き起こす細胞死に対して耐性を示す遺伝子のゲノムワイドスクリーニングを行った。このスクリーニングにより日本脳炎ウイルスの感染に関わる宿主因子を網羅的に同定することを目標としている。
昨年度までには遺伝子ノックアウト系および遺伝子発現活性化系それぞれを用いて日本脳炎ウイルス感染による細胞死を指標としたゲノムワイドスクリーニングを行い、日本脳炎ウイルスの感染に関わる宿主因子の候補を複数得ることができた。本年度は候補遺伝子のノックアウト細胞を作製し、日本脳炎ウイルス感染による細胞死に対する耐性を評価した。その結果、single guide RNA （sgRNA）によるオフターゲット作用ではないことを確認することができ、日本脳炎ウイルス感染による細胞死に耐性を与える責任遺伝子であることがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度までにゲノムワイドな遺伝子ノックアウトおよび発現活性化細胞群に日本脳炎ウイルスを感染させ、ウイルス感染による細胞死に耐性を示した細胞群を回収した。回収した細胞群からゲノムDNAを精製し、ゲノムに挿入されたsgRNAをPCRにより増幅し、次世代シーケンサーを用いて解読した。日本脳炎ウイルス感染なしのコントロールも同時に解析を行い、コントロールよりも過剰に検出されたsgRNAを日本脳炎ウイルスの感染に関わる遺伝子の候補とした。
本年度はそれぞれの候補遺伝子についてCISPR/CAS9システムによる遺伝子ノックアウトのためのsgRNAの設計を行った。このsgRNAを用いてノックアウト細胞株を樹立し、細胞の生存率を指標として日本脳炎ウイルスへの耐性を評価した。その結果、ノックアウト細胞株は日本脳炎ウイルス感染による細胞死に耐性であることを確認し、日本脳炎ウイルス感染による細胞死に耐性を与える責任遺伝子であることが明らかとなった。

Strategy for Future Research Activity

日本脳炎ウイルス感染による細胞死に耐性を与える責任遺伝子についてcDNAをクローニングし、本年度に樹立したノックアウト細胞のコンプリメント細胞を作製して耐性が消失することを確認する。また、樹立したノックアウト細胞に日本脳炎ウイルスを感染させ、ウイルスRNAの定量やウイルスタンパク質の免疫染色等を行う。日本脳炎ウイルスのライフサイクルのどの段階に関与する因子なのかを検証する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの流行により学会がオンライン開催となり、計上していた旅費をほとんど使用しなかったため次年度使用額が生じた。これは次年度に学会や論文での成果発表に使用する予定である。