2018 Fiscal Year Research-status Report

網羅的変異導入と遺伝子発現解析による治療用ヘルペスウイルスベクターの開発

Research Project

Project/Area Number	18K14927
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	塩澤裕介日本医科大学, 医学部, 助教 (60801511)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2020-03-31
Keywords	遺伝子治療 / ウイルスベクター / 遺伝子発現プロファイル
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターの医療実装を促進するため、DNAバーコーディング技術と網羅的遺伝子発現解析技術を用い、HSVゲノムの遺伝子改変および治療遺伝子挿入部位の二点についてのハイスループットスクリーニング法を開発することを目的としている。今年度はまず、HSVベクターの毒性を除くため、HSVゲノムにコードされる遺伝子の中から細胞毒性を有する遺伝子を欠失させる改変を行った。具体的には、野生型のHSVであるKOS株のゲノムからICP27、ICP4、ICP0の３つの遺伝子を除去した。ICP4とICP0はHSVゲノムに２コピーずつ存在するが、両コピーとも欠失させた。また、ICP22についてはプロモーターを改変し、ベクターが細胞に感染した直後には発現しないよう遺伝子発現の時期を調節した。最終的には、改変後のHSVゲノムに対して次世代シーケンサーによる塩基配列解析を行い、目的の遺伝子改変が施されていることを確認した。続いて、HSVベクターが標的組織に感染した後に転写活性が持続的に保たれる領域を明らかにするため、培養細胞株を用いたin vitroでの検討を行った。具体的には、作製した無毒化HSVベクターを培養細胞株に感染させ、細胞からRNAを経時的に抽出した。培養細胞株としては、神経系の細胞として神経芽細胞腫由来のIMR-32、肝臓由来の細胞としてHepG2を用いた。IMR-32に対してはレチノイン酸による処理を行い、ニューロンへの分化を促した後にHSVベクターを感染させた。今年度はこれらの培養細胞株の培養法および分化誘導法の確立と、RNAの抽出までを行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason HSVゲノムの遺伝子改変は一般に時間を要するため、毒性遺伝子の欠失改変には時間をようすることが予想されていた。ただ、ICP0を欠失させる改変に予想以上に時間を要した。最終的には、無事に意図した改変を施すことができた。上記の点を除けば、次の段階である治療遺伝子組み込みの至適領域を決定するための遺伝子発現解析に移ることができており、おおむね順調な進行であると言える。
Strategy for Future Research Activity	まず、治療遺伝子組み込みの至適領域を決定するため、HSVベクターを感染させた培養細胞株から抽出したRNAを用いて、ベクターゲノムの遺伝子発現プロファイルを明らかにする。具体的には、RNAシーケンシングにより持続的な転写活性領域を同定する。続いて、in vivoでの検討として、マウス・ラットの神経系にHSVベクターを投与し、培養細胞株と同様に継時的にRNAを抽出・RNAシーケンシング解析を行う。in vitroとin vivoの解析結果を併せて、治療遺伝子組み込みの至適領域を決定する。最終的には同領域にレポーター遺伝子を挿入し、標的部位での発現量や持続性を評価する。続いて、標的指向性や感染効率向上につながるHSVゲノムの遺伝子改変を明らかにする。HSVゲノムの改変は一般に、変異導入部位と相同配列を有するテンプレートとの組換えを利用する。そこで、本研究では変異と一対一対応したバーコードをテンプレートに組み込む。作製した多数のテンプレートをプールし、HSVゲノムの改変を行なう。得られた変異HSVライブラリを標的細胞に感染させ、感染前・後のウイルスDNA中のバーコードを次世代シーケンサーにより定量する。標的指向性や感染効率の改善に寄与する遺伝子改変に対応したバーコードは、感染前に比して割合が増加すると予想される。これにより有用な遺伝子改変を明らかにする。
Causes of Carryover	本研究室が入っている日本医科大学基礎大学院棟に新たに研究室が移ってくることとなり、2018年12月から2019年1月にかけて、フロア内で移転があった。その間、研究活動が一時的にストップすることがあり、使用を見込んでいた物品を購入する必要がなくなった。特に、HSVベクターの遺伝子改変と一対一対応するバーコードの人工合成を発注する予定としており、高額になると見込まれたが、これが次年度に延期となったことが大きい。バーコードの人工合成は2019年度に行う予定としており、繰越分から支出することとしている。その他は当初の予定通り助成金を使用させていただく予定である。