2019 Fiscal Year Research-status Report

網羅的変異導入と遺伝子発現解析による治療用ヘルペスウイルスベクターの開発

Research Project

Project/Area Number	18K14927
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	塩澤裕介日本医科大学, 医学部, 助教 (60801511)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	遺伝子治療 / ウイルスベクター / 遺伝子発現プロファイル
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターの医療実装を促進するため、DNAバーコーディング技術と網羅的遺伝子発現解析技術を用い、HSVゲノムの遺伝子改変および治療遺伝子挿入部位の二点についてのハイスループットスクリーニング法を開発することを目的としている。今年度はまず、HSVべクターが標的組織に感染した際、転写活性が持続的に保たれるベクターゲノム領域を明らかにするため、培養細胞株を用いたin vitroでの検討を行った。具体的には、毒性遺伝子を欠失させたHSVべクターを培養細胞株に感染させ、細胞からRNAを経時的に抽出した。培養細胞株としては、神経系の細胞として神経芽細胞腫由来のIMR-32、肝臓由来の細胞として肝細胞がん細胞株のHepG2を用いた。IMR-32に対してはレチノイン酸処理を５日間行い、ニューロンへの分化を促した後にHSVべクターを感染させた。抽出したRNAからcDNAを合成し、次世代シーケンサーによる遺伝子発現解析を行った。その結果、IMR-32とHepG2の双方において、感染後24時間まではUL39遺伝子の領域で転写活性が高いことが判明した。しかし、UL39領域の転写活性は、感染後３日から７日と時間が経つにつれて急激に低下していった。その一方で、LAT領域と呼ばれるゲノム領域の転写活性が持続的に保たれることが明らかになった。この結果、治療遺伝子組み込み部位としては、１）持続的な発現にはLAT領域、２）一過性の発現にはUL39領域、がそれぞれ適していると考えられた。この結果を受け、治療遺伝子組み込み部位としてLAT領域またはUL39領域にゲートウェイカセットを有するHSVベクターの作製を開始した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 2018年末から2019年初頭にかけて、研究棟内での研究室の移転があり、研究遂行に支障をきたした。研究自体についても、単純ヘルペスウイルスベクターの遺伝子改変に当初想定していた以上の時間を要した。これらの事由により、研究がやや遅れることとなった。
Strategy for Future Research Activity	治療遺伝子組み込みの至適領域について、in vitroでの検討から、１）持続的な発現にはLAT領域、２）一過性の発現にはUL39領域、がそれぞれ適していると考えられた。これがin vivoでも当てはまるかどうかを調べるため、マウスの神経系と肝臓にHSVベクターを投与し、継時的にRNAを抽出し、RNAシーケンシング解析を行う。in vitroとin vivoの解析結果を併せて、治療遺伝子組み込みの至適領域を決定する。最終的には同領域にレポーター遺伝子を挿入し、標的部位での発現量や持続性を評価する。レポーターとしてはAcGFP遺伝子とRedFLuc遺伝子を予定している。続いて、標的指向性や感染効率向上につながるHSVゲノムの遺伝子改変を明らかにする。HSVゲノムの改変は一般に、変異導入部位と相同配列を有するテンプレートとの組換えを利用する。そこで、本研究では変異と一対一対応したバーコードをテンプレートに組み込む。作製した多数のテンプレートをプールし、HSVゲノムの改変を行なう。得られた変異HSVライブラリを標的細胞に感染させ、感染前・後のウイルスDNA中のバーコードを次世代シーケンサーにより定量する。標的指向性や感染効率の改善に寄与する遺伝子改変に対応したバーコードは、感染前に比して割合が増加すると予想される。これにより有用な遺伝子改変の候補を抽出する。これらの候補については、該当する遺伝子改変を一つずつベクターゲノムに加え、治療遺伝子の発現量や発現持続性に及ぼす効果を調べる。これにより、ベクターの性能改善に資する遺伝子改変を最終的に明らかにする。
Causes of Carryover	研究棟内の移転により研究遂行に支障をきたしたことと、HSVゲノムの遺伝子改変に時間を要したため、当初予定していた実験に至らなかった。今年度は、前年度に予定していた実験に取り掛かるため、そのための試薬類に充てる。また、得られた成果についての学会発表も予定している。