網羅的変異導入と遺伝子発現解析による治療用ヘルペスウイルスベクターの開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K14927
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 塩澤 裕介 日本医科大学, 医学部, 助教 (60801511)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 遺伝子治療 / ウイルスベクター / 遺伝子発現プロファイル

Outline of Annual Research Achievements

前年度に行った、RNAシーケンシングによる単純ヘルペスウイルス（HSV）ゲノム由来の網羅的遺伝子発現解析により、治療遺伝子組み込み部位の至適領域の候補が同定された。領域ごとに遺伝子発現の持続性に違いがあることが明らかになり、このことから１）治療遺伝子を一過性に発現させたい場合、と２）持続的な発現を目指す場合、のそれぞれに適した領域があることが明らかになった。そこで、これらの領域にGatewayカセットを挿入した。Gatewayカセットを用いることで挿入遺伝子の交換が容易になり、HSVゲノム改変の煩雑さを避けることができるためである。持続的な発現に適した領域はHSVゲノムの反復配列中にあるが、本研究では毒性遺伝子を欠失させる際、junction領域を欠失させないように毒性遺伝子を一つずつ欠失させている。そのため、Gatewayカセットを２コピー挿入することができた。これにより、従来のHSVベクターと比べて２倍の遺伝子発現量が期待できることになる。Gatewayカセットを２コピー持つことで、治療遺伝子を挿入する際の操作が煩雑になることが懸念されたが、１回の組換え反応で一度に２コピーの遺伝子を挿入できるプロトコールを確立した。
現在、これらのベクターと従来のHSVベクターの比較を進めているところである。持続発現用のベクターは従来のベクターよりも生物学的力価が高い傾向にあり、遺伝子導入効率についても期待できる結果が得られている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2018年末から2019年初頭にかけて、研究棟内での研究室の移転があり、研究遂行に支障をきたした。また、2020年度に緊急事態宣言に伴い研究の遂行に支障を来たした。研究自体についても、単純ヘルペスウイルスベクターの遺伝子改変に当初想定していた以上の時間を要した。これらの事由により、研究がやや遅れることとなった。

Strategy for Future Research Activity

まず、治療遺伝子組み込みの至適領域についての検討がin vivoでも同様の結果が得られるかを調べるため、マウスの神経系と肝臓にHSVベクターを投与し、継時的にRNAを抽出し、RNAシーケンシング解析を行う。続いて、標的指向性や感染効率向上につながるHSVゲノムの遺伝子改変を明らかにする。HSVゲノムの改変は一般に、変異導入部位と相同配列を有するテンプレートとの組換えを利用する。そこで、本研究では変異と一対一対応したバーコードをテンプレートに組み込む。作製した多数のテンプレートをプールし、HSVゲノムの改変を行なう。得られた変異HSVライブラリを標的細胞に感染させ、感染前・後のウイルスDNA中のバーコードを次世代シーケンサーにより定量する。標的指向性や感染効率の改善に寄与する遺伝子改変に対応したバーコードは、感染前に比して割合が増加すると予想される。これにより有用な遺伝子改変の候補を抽出する。これらの候補については、該当する遺伝子改変を一つずつベクターゲノムに加え、治療遺伝子の発現量や発現持続性に及ぼす効果を調べる。これにより、ベクターの性能改善に資する遺伝子改変を最終的に明らかにする。

Causes of Carryover

研究棟内の移転により研究遂行に支障をきたしたことと、HSVゲノムの遺伝子改変に時間を要したこと、緊急事態宣言の発令により動物実験に支障をきたしたこと、などの事由により当初予定していた実験に至らなかった。今年度は、前年度に予定していた実験に取り掛かるため、そのための試薬類に充てる。