2018 Fiscal Year Research-status Report
ヒト腸内細菌由来C-配糖体代謝酵素の触媒機構の解明
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18K14940
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| Research Institution | Suzuka University of Medical Science |
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Principal Investigator |
中村 賢一 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助手 (70512002)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | puerarin / mangiferin / C-配糖体 / 腸内細菌 / 代謝酵素 / 結晶化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸内細菌による配糖体成分の代謝は、漢方薬の薬効発現と密接に関わっていると考えられている。天然に存在する配糖体の多くはO－配糖体であるが、一部、糖とアグリコンが直接C－C結合したC－配糖体も存在する。本研究では、C－配糖体を代謝する2種類のヒト腸内細菌株（キサントンC－配糖体mangiferinを代謝する腸内細菌株、イソフラボンC－配糖体puerarinを代謝する腸内細菌株）を用い、C－配糖体代謝酵素群の機能の解析と、C－C結合開裂反応の酵素触媒機構の解明を目的に研究を行った。
これまでの研究から、C－配糖体は中間体（糖部分3位酸化体）を経由する2段階の酵素反応により、アグリコンへと代謝されることが明らかになっている。本年度は、(1) mangiferinを3’-oxo-mangiferinへと代謝する腸内細菌由来の酸化酵素の機能解析を行った。具体的には、大腸菌を用いた組換えタンパク質発現系を構築し、得られた組換えタンパク質を用いてmangiferinを基質に酵素反応を行い、HPLC分析にて3’-oxo-mangiferinの生成を確認した。さらに、(2) 3”-oxo-puerarinをアグリコンへと代謝する酵素タンパク質の立体構造と酵素触媒機構を解明する目的で、結晶化スクリーニングキットによるタンパク質結晶化条件の検討を行った。その結果、ある条件においてタンパク質の微結晶を生じたが、十分な大きさの単結晶は得られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、C－配糖体の代謝に関与する未同定酵素のクローニングと機能の解析、およびC－C結合開裂反応を触媒する酵素タンパク質の結晶化条件の検討を行った。その結果、mangiferin酸化酵素を同定するとともに、3”-oxo-puerarin代謝酵素の微結晶を生じる結晶化条件を見出せたことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
C－C結合開裂反応を触媒する3’-oxo-mangiferin代謝酵素、3”-oxo-puerarin代謝酵素について、タンパク質の結晶化条件のスクリーニングと最適化を行い、十分な大きさの単結晶を得る。放射光施設を利用してX線回折実験を行い、タンパク質の立体構造を解析する。
また、C-配糖体代謝反応を促進するが、酵素活性が不明のタンパク質が存在するため、各種基質を用いて酵素反応を行い、代謝物を分析する手法により、未同定酵素の機能を解析する。
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| Causes of Carryover |
初年度に必要な実験機器を当初想定価格より安く購入できたため、次年度使用が生じた。次年度使用金は、各種消耗品費に使用する計画である。
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