2018 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
18K15015
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
|---|
Principal Investigator |
吉田 慶太 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (20808159)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | RNA干渉 / 小胞輸送 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、線虫においてRNA干渉を起こす二本鎖RNAが細胞間を伝播する現象（全身性RNAi）をモデルとして、機能性RNA輸送機構の解明を目指している。本年度は、これまでに得られていた全身性RNAiの変異体株から原因遺伝子を同定することを試みた。戻し交配を行った変異体株に対して次世代シーケンサーによる全ゲノム配列解析を行ったところ、6つの変異体株について原因遺伝子座を10Mb以内に絞り込むことに成功した。
また、ゲノム配列の解析により、変異体株のうち２株に共通してY39A3CL.1遺伝子へ変異が導入されていることを見出した。そこで、この遺伝子の欠失変異体の解析を行ったところ、全身性RNAiの異常が認められた。このことから、Y39A3CL.1遺伝子への変異が全身性RNAiの異常の原因であると結論付けた。この遺伝子の機能について解析するため、変異体をバックグラウンドとして、組織特異的に野生型遺伝子を発現するトランスジェニック株を作製した。作製した株についてRNAiへの応答を解析したところ、野生型遺伝子の発現組織以外でもRNAiの効果が回復することを見出した。この結果から、Y39A3CL.1が二本鎖RNAの細胞間の輸送に関わる因子であることが示唆される。
さらに、変異体株のうち1株においてtbc-3遺伝子にタンパク質合成が不完全に終結するナンセンス変異が起きていることを見出した。tbc-3遺伝子がコードするタンパク質は、細胞内小胞輸送の制御を担うRabの調節因子である。変異体株にtbc-3遺伝子の野生型配列を導入したところ、全身性RNAiの異常が回復した。さらに、CRISPR/Cas9法によりtbc-3遺伝子の変異体を新規に作製して解析したところ、全身性RNAiに異常が起きていることを確認した。以上の結果より、tbc-3遺伝子は新規の全身性RNAi関連因子であると考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
変異体株から2つの原因遺伝子を同定することに成功した。また、同定した因子は目的とする二本鎖RNAの輸送系に関与している可能性が高く、これらの因子の機能解析を進めることで当初の目的を達成できると考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
同定した因子の発現パターンと細胞内局在を解析する。新規因子と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現する株を作製し、蛍光タンパク質の発現パターンから発現組織を決定する。また、この株と初期エンドソーム、後期エンドソーム、トランスゴルジネットワークなど、細胞内の小胞輸送経路において蛍光タンパク質を発現する既存の株と掛け合わせ、どの因子と共局在するのかを観察することで、同定した新規の因子が細胞内のどの経路で機能するのかを明らかにする。また、機能する経路に関連する因子との関係について解析を行う。
|
| Causes of Carryover |
本年度は、使用予定を考慮して実体顕微鏡の部品を限定して購入した。
次年度以降に蛍光光源装置等、顕微鏡関連備品の拡充に使用する計画である。
|
