Simultaneous measurement for intracellular temperature and activity of thermosensitive TRP channel

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K15024
• Research Institution: Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences
• Principal Investigator: 宇治澤 知代 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 特別研究員 (10816515)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: TRPチャネル / 細胞内温度 / パッチクランプ

Outline of Annual Research Achievements

温度感受性TRPチャネルの活性化温度閾値は膜電流とパッチクランプされた細胞近傍の外溶液温度の同時計測から決定されている。しかし、細胞外からの熱刺激 による細胞内温度、さらにはTRPチャネルが発現する形質膜付近の温度が実際にどのように変化しているのかはわかっていない。今回、細胞内温度を計測できる蛍光温度プローブを用いて、細胞内温度と膜電流の同時計測を行う。蛍光温度プローブには1 励起2蛍光型のポリマータイプのものを使用し、ステージトップインキュベーターを用いて、室温からTRPV1活性化閾値付近である約40℃まで温度上昇させた際のレシオ値(細胞内温度)の変化を解析した。また、当初の使用予定であった顕微鏡装置を変更したことにより、実際に同時計測を行う際に使用する加熱装置には赤外線レーザーを用いることになった。そこで、赤外線レーザーの出力調整をおこなう必要があった。赤外線レーザーの照射径は最小0.8μmまで小さくすることが可能であり、細胞の一部のみを刺激することができる。赤外線レーザーの出力値を等間隔で上昇させ、照射中の温度プローブを導入させた細胞の画像取得をおこない、そのレシオ値を上記のステージトップインキュベーターを用いた際のレシオ値と対応させることで、赤外線レーザーの出力値と加熱量を求めた。
同時計測システムとして、赤外線レーザー搭載の共焦点顕微鏡にパッチクランプシステムを組み合わせた。ところが、付属のステージチャンバーでは細胞へのアプローチが困難であったため、新たにチャンバーを作製した。そのうえで、HEK293細胞のrat TRPV1定常発現株における周辺ノイズを除去したチャネル電流を記録することができた。上記の通り、システムの改良に時間を要したが、細胞内温度と膜電流の同時計測をおこなう環境を整えることができた。