2019 Fiscal Year Annual Research Report
Dissecting the physiological roles of CNOT4 ubiquitin ligase for prevention of fetal growth restriction.
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18K15038
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
山口 智和 秋田大学, 医学系研究科, 助教 (30749940)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | CNOT4 / ユビキチン転移酵素 / 胚発生 / 細胞増殖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CNOT4による分子制御機構の解明のため、令和元年度は下記の項目を検討した。
1) CNOT4 floxed マウスの作製：組織特異的なCNOT4遺伝子欠損の表現型解析のため、CRISPR/CAS9ゲノム編集によりCNOT4 floxedマウスを作製した。開始コドンを含むExon2の上流、及びExon3下流のイントロン領域を標的とするgRNAを設計し、loxP配列を含むssODN、CAS9 Nucleaseと共にマウス受精卵に顕微注入後、個体化を行った。得られたCnot4flox/floxマウスをCreTg/+マウスに交配後、産子マウス組織におけるCNOT4の消失をウェスタンブロットにて検出した。
2)CNOT4欠損MEFの表現型解析：Cnot4flox/flox; CAG-Cre/Esr1Tg/+マウス同士の交配後、受精後13.5日の胎児からMEFを単離した。タモキシフェン添加によりCNOT4の欠損を誘導したところ、添加後2日で細胞増殖の低下を認めた。さらに、FACS解析の結果、CNOT4の欠損により細胞死(PI染色)陽性細胞の有意な増加を認めた。この結果から、CNOT4が細胞の増殖や細胞死抑制に重要であることがわかった。
3)CNOT4によるmRNA制御の解析： HEK293T細胞におけるCNOT4遺伝子の発現抑制は胚発生関連遺伝子の発現を減少させることが、前年度のRNAseq解析により明らかとなった。RIP解析の結果、その中でも細胞増殖に重要なgeneXがCNOT4に強固に結合していることがわかった。さらに、CNOT4のRNA認識ドメイン欠損体ではその結合が消失しており、CNOT4の発現抑制はgeneX mRNAの安定性を低下させたことから、CNOT4はgeneX mRNAに結合し安定的に発現を維持することで細胞増殖や胚の発生に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] B38-CAP is a bacteria-derived ACE2-like enzyme that suppresses hypertension and cardiac dysfunction2020
Author(s)
T. Minato, S. Nirasawa, T. Sato, T. Yamaguchi, M. Hoshizaki, T. Inagaki, K. Nakahara, T. Yoshihashi, R. Ozawa, S. Yokota, M. Natsui, S. Koyota, T. Yoshiya, K. Yoshizawa-Kumagaye, S. Motoyama, T. Gotoh, Y. Nakaoka, J. M. Penninger, H. Watanabe, Y. Imai, S. Takahashi, K. Kuba
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 11
Pages: 1-12
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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