2018 Fiscal Year Research-status Report
核－細胞質間の輸送因子による脳機能制御と精神疾患の発症機序の解明
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18K15044
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
盛山 哲嗣 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (50627990)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | エストロゲン受容体 / 核－細胞質間輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、エストロゲン受容体α (ERα)の細胞内分布とシャトリングに着目した。現在までに行った研究は以下の通りである。
ERαと核内輸送因子importin αとの関係性を明らかにするため結合実験を行ったところ、両者の結合が確認され、さらにリガンドであるE2の添加によりその結合が強化された。またERαの細胞内局在も、E2を加えるとさらに核内に集まった。importin αと結合できないERαを作製しその細胞内局在を調べると、野生型に比べて細胞質側に多く確認された。以上のことから、ERαの核内輸送にimportin αが関わっていることが示唆された。また興味深いことに、E2の添加により核内の変異型ERαのさらなる減少が確認された。
次に、このE2の添加による核内の変異型ERαの減少に注目した。既知のERαの核外輸送因子CRM1の阻害剤であるLeptomycin Bを加えても、この減少をあまり阻害されないことから、他の核－細胞質間輸送因子による核外輸送が、核内の変異型ERαの減少を引き起こしていると推測した。そこで、各々の輸送因子に対するsiRNAを複数作成し、Real-time PCRにより発現抑制効果を確認し、核－細胞質間輸送因子のsiRNAライブラリーを構築した。そして、このライブラリーにより各々の輸送因子が抑制された細胞に変異型ERαを導入し、E2の添加による核内の変異型ERαの減少の阻害効果を確認することで、輸送因子を絞り込んだ。さらに、その輸送因子と野生型及び変異型ERαとの結合を調べると、E2の添加によりその結合が強くなることが確認された。またERαを発現しているMCF7細胞で、その輸送因子の発現抑制したところ、内在性のERαがコントロールに比べて核内に集積している様子が確認された。以上の結果より、特定した輸送因子がERαの核から細胞質への移動に関わる新たな因子であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画の通り、ERαの新たなシャトリングメカニズムがおおむね順調に解明されつつある。一方で、特定した輸送因子が、ERαの核外輸送因子であると当初考えていたが、輸送以外の役割により、ERαを細胞質側に留めていることを示唆する結果も得られており、現在詳細に解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、ERαと見出した輸送因子との関係性の解析を進めていく。さらに、神経細胞におけるERαの細胞内分布およびエストロゲンによるスパイン増加効果における核－細胞質間輸送因子の役割を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
核－細胞質間輸送因子のsiRNAライブラリーをセレクションする際に、各ターゲット遺伝子に対して少量のsiRNAを数種類ずつ注文し、スモールスケールで確認することで、低コストで発現抑制効果の高いライブラリーが得られた。次年度は、見出した輸送因子の役割の解析のために、その輸送因子に対するsiRNAのボリュームを増やして購入したり、解析に必要な試薬などに使用する予定である。
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