2019 Fiscal Year Research-status Report
複数のCRISPR/Casを用いたDNA構造の改変と転写制御機構の解析
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18K15045
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
佐藤 克哉 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60733508)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9 / AID / Aicda / 遺伝子転写調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集が比較的容易に行えるようになってきた。また様々な生物のCas9やCas9の変異体、遺伝子切断活性不活性化型のdCas9と蛍光タンパク質などの融合タンパク質を活用する事により、これらをゲノム編集以外の様々な研究に活用しようとする試みも盛んに行われている。
本研究は、Bリンパ球において抗体改変に必須のタンパク質であるAIDに着目し、Bリンパ球活性化時にAID遺伝子 (Aicda) 周辺の領域に広範にわたり散在する転写調節領域とそれらに結合する複数の転写調節因子が構成する遺伝子座の立体的な状態を上述したCRISPR/Cas9 systemを用いて明らかにしようとするものである。
Bリンパ球活性化時におけるこれらの転写調節因子や遺伝子調節領域の巨視的な構造変化における転写活性の仕組みを理解することは、抗体産生のメカニズムや効率的なワクチン開発等への応用が考えられる。
昨年度、dCas9-VP64を活用し、各DNA調節領域のAicda遺伝子発現への寄与を検討した。また、各種蛍光タンパク質融合型のdCas9、およびルシフェラーゼを発現するコンストラクト作製を行い、生物発光を利用したBリンパ球活性化時・非活性時のDNA構造の解明を試みた。今年度も、引き続きルシフェラーゼ実験系を活用し、発現調節領域の遺伝子転写活性への寄与を検討するとともに、B細胞活性化時のAicda遺伝子座の立体構造を明らかにすべく、新たな変異体Cas9発現コンストラクトの作成、およびそのdCas9変異体の細胞内における挙動とdCas9-VP64における発現コンストラクトの挙動の比較を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、昨年度に引き続き、dCas9-VP64および、ルシフェラーゼを用いたDNA立体構造の解明を試みた。また同時に、新たなdCas9変異体の作成を行い、Aicda遺伝子周辺の転写調節領域間および転写調節領域とプロモーターとが形成する立体構造の解明を試みた。しかしながら、ルシフェラーゼを導入した細胞では十分な発光強度を得ることができなかった。このため、dCas9-VP64を含むdCas9と融合タンパク質間のリンカーの配列および、長さを再検討している。一方、これまでChIP-Seqなど、Aicda遺伝子発現に関わる様々な転写因子を用いた転写因子-DNA共沈降物の配列解析が行われている。これらの情報を利用し、Aicda遺伝子領域の内どの領域が最も寄与し得るかを併せて検討するとともにChIP-qPCR等を用いることで確認を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
先行研究やこれまでの知見から、各種タンパク質を融合させたCas9変異体の利用には、Cas9の立体性やリンカー配列などを考慮する必要があると考えられた。より感度の高いDNA立体構造の検出系を構築する為に、精密な条件検討を続ける必要があると考えられる。また、既存のChIP-seqデータを利用した上で、ChIP-qPCR等を実施することで、Aicda遺伝子周辺の遺伝子発現に対する重要配列の確認を行いたい。作成したdCas9変異体がAicda遺伝子発現に与える影響についても引き続き確認していく予定である。
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| Causes of Carryover |
新たに作成したdCas9変異体を用いて条件検討等を行ったが、dCas9と融合タンパク質の立体障害などを考慮し、より精密な条件検討が必要であると考えられた。このため、予定していた細胞を用いた一部アッセイを実施することが出来なかった。このため残予算が生じたが、研究計画に従い、次年度行う研究と併せてこのdCas9変異体を用いた実験を遂行したい。
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