2020 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of transcriptional regulation mechanisms and artificial modification of DNA structure by CRISPR/Cas system.
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18K15045
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
佐藤 克哉 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60733508)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | AID / 遺伝子発現制御 / CRISPR/Cas9 / Aicda |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集が容易に行えるようになった。また遺伝子切断活性不活性化型のdCas9と機能的タンパク質との融合タンパク質を用いる事により、標的遺伝子への部位特異的な修飾の導入や他のタンパク質を標的DNA領域に誘導する事が可能となった。本研究では、これらの技術を活用し、Bリンパ球において抗体遺伝子改変に必須のタンパク質であるAIDの遺伝子座の立体的な状態を解明する事を目的とした。Bリンパ球活性化/非活性化時におけるAID遺伝子領域の巨視的な構造変化における転写活性の仕組みを理解することで、抗体産生のメカニズムの解明や効率的なワクチン開発等への応用が期待できる。
本年度は、昨年度に引き続き、dCas9-VP64を用いてAID遺伝子に散在する発現調節領域の寄与を調査した。また、ルシフェラーゼを利用したBリンパ球活性化時・非活性時のDNA構造の解明を試みた。今年度はこれらに加え、遺伝子活性化時のDNA構造を再現することでAID発現の誘導を試みた。しかしながら、Cas9タンパク質と融合タンパク質との物理的干渉などから十分なAIDの発現誘導が得られなかった。現在、Cas9融合タンパク質の構造などの再検討を行っており、引き続き調査を続ける予定である。
そこで、AID遺伝子発現調節に直接関わる転写因子とそれらが標的とする遺伝子配列ついても検討した。これまで、IRF4やBatfといった転写因子がAIDの遺伝子発現に関わることが示されている。IRF4は、種々の転写因子と複合体を形成することができ、形成する複合体によって標的DNA領域が変化する。IRF4の既知の結合パートナーとしてBatfの他にPU.1が知られているため、これらに着目した。その結果、我々の実験系では、IRF4はPU.1よりもBatfやJunと複合体を形成することでAIDを強く誘導することが示唆された。
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