2018 Fiscal Year Research-status Report
喘息発症におけるシグナル伝達p38-MK2経路の役割解明
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18K15049
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
早川 裕子 自治医科大学, 医学部, 客員研究員 (80626929)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 喘息 / モデルマウス / IL-33 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
喘息は、気道炎症を伴うアレルギー疾患である。喘息病態に関与する肺2型自然リンパ球（ILC2）は、サイトカインIL-33に反応して、気道炎症を誘導するサイトカインIL-5とIL-13を産生する。このため、喘息の発症を抑えるには、IL-33と肺ILC2を制御することが重要である。これまでのIL-33シグナル伝達の解析から、p38経路の下流にあるリン酸化酵素MK2がサイトカインの産生に関与することを見出した。p38-MK2経路の下流シグナルが、サイトカイン発現をどのように制御しているのか明らかにするために、所属研究室と本学実験医学センターとの共同研究により、喘息発症に関わるシグナル伝達因子の遺伝子欠損マウスを作製した。また、単離した肺ILC2のサイトカイン産生に対するMK2阻害剤の抑制効果を検討した。
（1）MK2およびMK3の遺伝子欠損マウスの作製
遺伝子欠損マウスは、CRISPR/Cas9法を用いたゲノム編集により作製した。MK2欠損マウスについてはヘテロ接合型個体を得た。また、喘息発症には、MK2と同様にp38によってリン酸化されるMK3の関与も示唆された。そのため、MK3欠損マウスの作製に着手し、ホモ接合型個体を得た。
（2）IL-33刺激に対する肺ILC2の細胞応答の解析
C57BL/6系統野生型雌マウスの肺から、セルソーターによりILC2を単離した。MK2阻害剤存在下において肺ILC2をIL-33で刺激した後、ELISA法とフローサイトメトリー（FCM）法を用いてサイトカイン産生を解析し、MK2阻害によってIL-5とIL-13の産生が低下することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成30年度は、本学で進められていた実験動物飼育施設のリニューアル計画が遅延し、遺伝子欠損マウスの作製や外部施設からの導入が完了せず、本研究計画にも遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
野生型マウスと同様に、p38α欠損マウス、MK2欠損マウス、MK3欠損マウスの肺から、セルソーターによりILC2を単離し、IL-33で刺激した後、ELISA法とフローサイトメトリー（FCM）法を用いて、サイトカイン産生、細胞増殖、細胞死を調べる。また、単離した肺ILC2をIL-33で刺激した後、マイクロアレイ解析により遺伝子発現差異を調べる。マイクロアレイ解析は受託業者に依頼する。遺伝子発現データからヒートマップを作製し、p38-MK2/3経路の下流分子を同定する。さらに、各マウスで喘息モデルを作製し、喘息病態を比較する。
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| Causes of Carryover |
（理由）平成30年度は、本学実験動物飼育施設のリニューアル工事遅延のため、マウスを用いる実験計画にも遅れが生じた。とくに、平成30年度に予定していたマウス肺ILC2の機能解析およびマイクロアレイ解析を平成31年度に移行したため、その解析費用などを次年度に繰り越した。
（使用計画）次年度繰越費用は、p38α欠損マウス、MK2欠損マウス、MK3欠損マウスの肺ILC2におけるサイトカイン産生、細胞増殖、細胞死を調べるため、抗体、試薬類、ELISAキットの購入費、および、マウス維持費に用いる。また、肺ILC2のマイクロアレイ解析の外注費に用いる。
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