2018 Fiscal Year Research-status Report
細胞・組織横断的ゲノムワイドメチル化解析によるナルコレプシーの神経脱落機序の解明
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18K15053
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
杉本 美穂子 (嶋多美穂子) 公益財団法人東京都医学総合研究所, 精神行動医学研究分野, 研究員 (50792727)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ナルコレプシー / CD4+ T細胞 / CD8+ T細胞 / 後部視床下部 / DNAメチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ナルコレプシー発症の原因となる後部視床下部でのオレキシン神経の脱落が起こる機序を解明するために、脳の後部視床下部と神経脱落への関与が示唆されている免疫細胞の双方でエピジェネティックな変化を検討する。そのために2018年度は、まず脳の後部視床下部において免疫的な異常が起こった痕跡があるかの検討を実施した。具体的な方法としては、脳内免疫異常が原因となり発症する他の神経疾患である多発性硬化症の脳細胞において、患者群で変化しているDNAメチル化部位がナルコレプシーのそれと有意に重複するのかを検討する解析手法を検討・実施した。その結果、他の精神・神経疾患では見られなかったナルコレプシー関連メチル化部位との有意な重複が多発性硬化症でのみ検出された。これはDNAメチル化という観点からも、ナルコレプシーにおいて脳内での免疫的機序の異常が疾患発症の契機となった可能性があることを示唆する。そこで、免疫細胞の側からの検討も実施するために、CD8+ T細胞並びにCD4+ T細胞におけるDNAメチル化測定の準備を実施した。具体的には、上記2種類の細胞を分離する方法についての検討を実施し、磁気ビーズを用いた分離方法を採用することとした。同時に、DNAメチル化は環境因子の影響を受けやすいことから、採血時間や絶食下であるか否かなどのサンプルの諸条件が揃っていることが交絡因子を除去する上で重要である。このような背景情報の偏りを考慮して、我々の研究室で収集している血液サンプルのうち解析に適したサンプルの選定も進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では、ナルコレプシーの発症機序において重要な役割を果たしていることが推察される細胞ならびに組織を横断的に検討することである。その一環として、まずはじめにオレキシン神経の脱落が起こっている脳の後部視床下部の組織における免疫的異常の影響を受けて変化しているDNAメチル化部位の探索を実施した。関連する実験・解析については全て完了し、ナルコレプシーと多発性硬化症に関連するDNAメチル化部位との有意な重複を確認した。これは、ナルコレプシーの脳においても免疫系の異常が起こっている可能性があるという、次に行うCD8+ T細胞並びにCD4+ T細胞ごとのDNAメチル化解析につながる結果である。
CD8+ T細胞並びにCD4+ T細胞での実験・解析についても、すでにサンプルごとの詳細な背景情報の整理を踏まえたサンプルの選定を実施済みである。細胞の分離方法の検討についても実施しており、2019年度すぐに実験が開始できる状況にある。以上を踏まえ、2019年度中には当初の計画通り目的の結果を得ることが可能であることが見込まれるため、おおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は選定した患者並びに対照群の血液サンプルから、実際にCD8+ T細胞並びにCD4+ T細胞を分離し、DNA抽出を実施する。抽出したDNAを用いて、脳組織で実施したのと同様のアレイベースのプラットフォームを用いて網羅的なDNAメチル化解析を実施する。
得られたデータを用いて、各細胞においてメチル化のパターンが異なっているか、また特に疾患と関連を示すメチル化部位が集積している細胞が存在するかを探索するために、主成分分析または多次元尺度法によりサンプル間の類似性を比較し、細胞種、（細胞種）×（患者or 健常者）ごとのメチル化プロファイルの違いについて検討する。
次に、真に疾患に関連するメチル化部位を同定するために、メチル化に影響を与える可能性のある因子（年齢、喫煙状況、BMIなど）についての評価を実施すると共に、未知の交絡因子についても考慮するため、主成分分析の主成分についても共変量として検討を実施する。交絡因子との関連が確認されたメチル化部位については、Stepwise法により変数選択を実施し、最適なモデルにて疾患との関連を評価する。以上により免疫細胞ごとに交絡因子の影響を調整した上で真に疾患との関連を示すメチル化部位を特定する。
さらに、脳で得たデータとの比較も実施することで、それぞれの組織・細胞における関連メチル化部位を、各組織・細胞特異的な部位と、組織間で共有されている部位とに細かく分類し、各分類で関連しているパスウェイを統合的に解釈し、オレキシン神経脱落に関わる生物学的機序を探索する。
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| Causes of Carryover |
CD4+ T細胞とCDD8+ T細胞の分離実験を、全てのサンプルについて2018年度中に実施する予定としていたが、サンプルの選定などの関係でその作業が2019年度となったため、試薬購入代として2019年度使用額が生じた。
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