2019 Fiscal Year Research-status Report
ORP11はどのようにしてNPC細胞のコレステロール蓄積を軽減するのか
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18K15066
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
仲宗根 眞恵 鳥取大学, 医学部, 助教 (30632947)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ニーマン・ピック / コレステロール / 小胞輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニーマン・ピック病Ｃ型 (Niemann-Pick disease type C: NPC)の原因遺伝子産物 NPC1は、エンドゾーム系からのコレステロールの排出に必要な膜蛋白質であり、欠損細胞では後期エンドゾーム・ライソゾーム (LE/Lys)にコレステロールが蓄積する。一方、ORP (OSBP-related protein)ファミリーは、OSBP(oxysterol-binding protein)とそのホモログ (ORP1~11)計12種類の蛋白質からなり、その各々が細胞の特定の場所で、特定の脂質のセンサーまたはキャリアーとして働くことが明らかになりつつある。われわれはこれまでに、NPC1欠損CHO細胞にORP11を過剰発現するとコレステロールの蓄積が減少・消失すること、ORP11は低分子量G蛋白質Rab9と複合体を形成することを発見した。本研究の第一の目的は、ORP11がLE/Lysからのコレステロール排出を促進する機序を明らかにすることである。
この目的に向かって、ORP11とRab9の結合様式をさらに詳細に検討し、結合に必要なORP11の配列部位を同定し、さらにその結合は直接であり介在蛋白質は不要であることを示した。また、NPC1欠損CHO細胞ではコレステロール以外に糖脂質もLE/Lysに蓄積するが、ORP11を過剰発現させることで糖脂質の蓄積も軽減することがわかった。これらの結果はORP11が（非小胞性輸送ではなく）Rab9依存性の小胞輸送を活性化することを示唆する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの主要な結果は、以下の 4点に要約される。
第一に、 Rab9との結合に必要な ORP11の配列部位を同定した。ORP11は２つの脂質結合部位 PHD と ORD をそれぞれ N末端と C末端に持つ。 PHDと ORDに挟まれた配列を Midseqと呼ぶ。 PHD, Midseq,ORDの各々を欠失するリコンビナントを作成し、GFP標識 Rab9との共免沈実験を行ったところ、Rab9は Midseqに結合することが判明した。このことは Rab9と ORP11の結合は、 ORP11の脂質結合能に依存しないことを示唆する。第二に、 Rab9と ORP11が直接結合することを GST融合蛋白質を用いた in vitroの結合実験で証明した。具体的には、Rab9-GSTから切り出した Rab9は、グルタチオン・ビーズに固相化した Midseq-GSTに結合した。第三に、NPC1欠損 CHO細胞に ORP11を過剰発現させると糖脂質の蓄積も軽減することを BODPY標識ラクトシルセラミドをプローブとして証明した。すなわち ORP11が（非小胞性輸送ではなく） Rab9依存性の小胞輸送を活性化することが示唆された。第四に、ORP11/Rab9複合体にORP9が含まれることがわかった。ORP9もORP11のMidseq に直接結合するが、その結合部位はRb9の結合部位とは異なることを示した。NPC1欠損CHO細胞でのORP11過剰発現の効果は、ORP9のdominant negative formで阻害され、ORP11の効果はその下流のORP9に依存することがわかった。
これらの結果は、ORP11が LE/Lysからの脂質排出を促進する機序を明らかにする上で重要な知見であり、研究はおおむね順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
NPC1欠損CHO細胞においてORP11がLE/Lysからのコレステロール排出を促進する機序について「ORP11がRab9とORP9の橋渡しをすることにより脂質の小胞輸送を促進する」という仮説を設定し、その検証を試みる。ORP9以外の候補蛋白質の同定を目的として、ORP11-GST融合蛋白質をプローブとしたORP11/Rab9複合体の精製を試みる。具体的には、ORP11-GSTをグルタチオン・ビーズに固相化したカラムを作製し、HepG2細胞抽出物からORP11/Rab9複合体を回収する。これに含まれる蛋白質を質量分析により同定する。得られた蛋白質おのおのについて、i)それらを6xHis融合蛋白質として作製し、in vitroでの複合体再構成実験を試みるのと並行して、ii) siRNA knockdownがNPC1依存性コレステロール輸送に及ぼす効果を検討する。
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Research Products
(1 results)
