2019 Fiscal Year Research-status Report

XORのC末端領域は、血管内皮障害をもたらすXORの活性変換のトリガーとなるか

Research Project

Project/Area Number	18K15070
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	藤原めぐみ日本医科大学, 医学部, 助教 (30648605)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	血管内皮 / XOR / D/O変換 / サルベージ経路
Outline of Annual Research Achievements	血管内皮のXORは活性変換(D/O変換)を起こして酸化酵素型（XO）をとると、H2O2とO2-を産生して血管内皮障害に寄与し得るが、その機序は細胞および組織レベルでは不明である。本研究では、C末端領域が関与すると思われるD/O変換が引き金となる活性酸素精製、プリン代謝変化の解析を行った。初年度は、ヒト血管内皮細胞(HUVEC)におけるD/O変換時における細胞内XORの局在変化および膜との相互作用について解析を試みたが、培養条件を検討によらず同細胞での発現は確認できなかった。次にGFP-fusion XORを発現させ、発現と局在の確認に至った。しかし発現細胞は細胞障害が大きく、アポトーシスを多く生じたため、解析が困難であった。そのため、二年目はXOによる血管内皮障害の機序に着眼し、XOR阻害薬による内皮保護効果について解析した。障害範囲を厳密に局限しやすいことから電子線照射を採用し、作製した放射線性皮膚炎モデルマウスに対して、XOR阻害薬は血管内皮障害および皮膚炎を軽減し、同時に血中ヒポキサンチン(Hx)濃度を増加させた。このため、XOR阻害薬による血管内皮保護効果の機序として、①XOによるH2O2とO2-産生の阻害か、②細胞内アデニンヌクレオチドの分解で生じるHxの再利用(サルベージ経路)の賦活化、の二つを想定し、放射線照射により生じるプリン代謝物変化、細胞障害マーカーを細胞レベルで検討した。Hx存在下では放射線照射後の細胞内ATP、ADPおよびAMP濃度が増加し、細胞生存性が増加した。また、Hx存在下では放射線照射後のDNA障害の程度および内皮細胞のアポトーシス数も有意に低下した。したがって、XOR阻害薬はサルベージ経路の賦活化により細胞内ATPを増加させ、放射線障害によるDNA障害ならびにアポトーシスを減少させることで内皮細胞保護にはたらくことが明らかとなった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究で明らかになったXOR阻害剤による血管内皮保護効果の機序については、 ①第92回日本生化学会大会における成果発表　②特許申請を既に終えている。 ②については、キサンチン酸化還元酵素阻害剤を含む皮膚障害の予防または治療のための医薬組成物に関する内容で、「皮膚障害の予防または治療のための医薬組成物」として特許を申請した。また、今後は論文投稿準備を進める予定である。
Strategy for Future Research Activity	本研究では、細胞レベルでのXOR阻害による血管内皮保護効果について検討し、XOR阻害によるHxの局所的な増加がサルベージ経路を介したATPの再利用を増加させることで血管内皮保護作用を増強する機序が明らかとなった。最終年度では、放射線皮膚障害モデルマウスを用いて個体レベルでの効果に関して、より詳細な検討を行うとともに、研究結果を論文にまとめるための補助的なデータの採集を行っていく方針である。
Causes of Carryover	本研究では、前述のとおり、研究内容の変更を行ったため、それにともない購入を予定していた抗体等の購入がなくなった。翌年度分においては、動物実験の追加実験およびELISA等の追加実験が必要となるため、その経費として使用する予定である。