2018 Fiscal Year Research-status Report
ファブリー病のミスセンス変異と機能的多型の分子病態の解析と診断への応用
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18K15071
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| Research Institution | Meiji Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
月村 考宏 明治薬科大学, 薬学部, 助教 (50632783)
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2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ライソゾーム病 / 遺伝子変異 / 臨床表現型 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ファブリー病は、リソソーム性加水分解酵素であるα-ガラクトシダーゼA（GLA）の活性低下により、基質である糖脂質が全身の細胞に蓄積するX染色体性の遺伝病である。近年、アミノ酸置換を起こすにもかかわらずファブリー病を発症しない機能的多型が見つかっており、臨床では新規アミノ酸置換が見つかった場合、病因変異であるか機能的多型であるかを判断することが困難であるため問題となっている。本研究では特に軽度な臨床症状を引き起こすミスセンス変異3種類(p.R112H, p.N215S, p.M296I)と機能的多型4種類(p.E66Q, p.R118C, p.A143Y, p.D313Y)を蛋白質レベルで比較し、病気と非病気の境界を解明することを目的とした。
今年度は、COS-7細胞に野生型、ミスセンス変異3種類と機能的多型4種類を一過性過剰発現させ、経時的にGLA活性とGLA蛋白質量を解析した。機能的多型の方がミスセンス変異に比べて共に大きい傾向がみられたが、機能的多型のなかでもp.R118Cとp.A143Tはp.E66Qとp.D313Yに比べて低く、ミスセンス変異に近い値を示すことが確認された。また、精製酵素を作製し各変異酵素の性状解析をするために、各変異GLA蛋白質を培養液中に分泌するメタノール資化性酵母株（計7株）を樹立した。そして、野生型とミスセンス変異2種類については、培養・精製を行い、各1mgの精製酵素を作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
COS-7細胞を用いた一過性過剰発現実験を行うことで、ミスセンス変異と機能的多型の細胞内での発現が異なるが、その差は大きくないことを確認することができた。また、来年度に解析予定である精製酵素を作製するための発現酵母株も全て樹立できており、すでに3種類の精製酵素を得ることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
残りの変異GLA蛋白質5種類についても精製酵素を作製する。そして、精製酵素を用いて性状を解析する。具体的には、1)酵素学的パラメータ（Km, Vmax）の算出、2)天然基質を用いたGLA活性の測定、3)リソソームのpHである酸性条件とその他の細胞小器官のpHである中性条件における熱安定性(残存活性、熱変性温度)の解析を行う。
また、分子モデルソフトTINKERを用いて変異GLA蛋白質の立体構造モデルを構築する。そして、アミノ酸置換により影響を受けたGLA分子内の原子の数とその移動距離を解析する。
以上のin vitroとin silicoによる蛋白質レベルの解析結果と今まで解析してきた患者情報と臨床検体の解析結果を統合することにより、ファブリー病の分子病態の解明を進めるとともに蛋白質レベルで病気と非病気の境界の解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
本年度途中から海外留学をしたため、年度後半は助成金を使用しなかった。本年度に発生した次年度使用額は、翌年度として請求した助成金と合わせて使用を計画している。
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