2018 Fiscal Year Research-status Report
タイト結合分子オクルディンを標的とした新規C型肝炎阻害薬の作用機序解明
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18K15085
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
齋藤 明 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (70791010)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | タイト結合分子 / オクルディン内在化 / Ajubaノックアウト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、本研究で作成したマウス抗ヒトオクルディン単クローン抗体(67-2)のエピトープを調べるため、オクルディンの第二細胞外ループのアミノ酸配列(214-224番目)の各領域に変異を加えた安定発現細胞株(ヒト肝癌由来細胞株：Huh7.5.1)を作成した。この変異細胞株を用いてHCVの感染率を調べることにより、本抗体のエピトープが明らかになった。またトランスウェルに培養した細胞層の経上皮電気抵抗(TER)を調べたところ、本抗体の投与の有無に関わらず、細胞層のバリア機能に変化は見られなかったことが分かった。
蛍光免疫染色法を用いてアミノ酸のN末端から216番目のシステインをアラニンに置換した細胞株において、オクルディンが膜領域から消失する様子が見られた。既報ではこの部位のアミノ酸置換によりHCVの感染率が低下したことがRT-PCRにより示されているが、本結果からHCVがオクルディンを認識しエントリーする過程を経るためには、膜領域に局在するオクルディンの高次構造が保持されていることが必要であると示唆された。
オクルディンが細胞質に内在化する作用機序を特定するにあたって、これにインタラクションしていると思われる膜タンパク質分子を網羅的にノックアウトして調べた。この結果、ヒッポシグナル伝達経路のシグナル伝達に関係していると言われているヒトAjubaが関連していることが明らかになった。また、内在化オクルディンはオートファゴソーム膜形成のマーカーの一つであるLC3と共局在することが明らかになり、オートファジー経路にも何かしら関与していることが示された。オクルディンはHCV感染の成立に必須であるが、その役割がほとんど分かっていない宿主因子であるため、この機構の詳細が明らかになればオクルディンの本質的な役割を解明できると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者らは、樹立済みのヒトオクルディン遺伝子ノックアウト株(Huh7.5.1)に、本抗体の候補エピトープを置換したFLAGタグ付変異オクルディン発現ベクターを導入した。これにより10種類のオクルディン変異発現細胞株(Huh7.5.1細胞)を樹立できた。また、その変異株を用いてマウス抗ヒトオクルディン単クローン抗体のエピトープを明らかにした。また、オクルディン抗体およびFLAG抗体を用いた蛍光免疫染色によりオクルディンの細胞内局在に及ぼす影響を調べるまでに至った。特にノックアウト実験により、Ajuba分子がオクルディンの内在化に関連する可能性を見出したことは、本研究での大きな進展といえる。
以上の理由を踏まえ、上記の評価を下した。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請者らは、ヒトオクルディンの第二細胞外ドメインのヒト特異的アミノ酸がクローディン1との結合に必要でHCV感受性を規定しているという仮説を立て、これら4つのヒト特異的アミノ酸をマウス型に置換した変異細胞株を樹立した。当初の予定通り、今後はHCV感染後のオクルディンとクローディン1の複合体形成の有無について免疫沈降やproximity ligation assayをして明らかにしていく予定である。加えて、他のHCV感染に必要な宿主因子であるヒトCD81についても同様の検討を行う予定である。
またAjuba分子がノックアウトされることにより、オクルディンが細胞質へ内在化する理由を特定する。オクルディンは膜貫通分子であり、通常は高い割合で膜領域に局在している。このため、オクルディンが内在化するに至るまでに何かしらの経路を辿っていることが考えられるので、その経路を特定する。具体的には、代表されるエンドサイトーシス経路(クラスリン依存性、カベオラ依存性、マクロピノサイトーシス)の各種阻害剤をAjubaノックアウト細胞に処置した上でオクルディンが内在化されるか評価する。また、オクルディン以外にもAjubaノックアウト細胞で内在化する分子が存在するかを免疫蛍光染色によって調べる。さらに、この内在化経路の先の過程として、リソソーム分解経路に回っているかをオートファゴソームとリソソームマーカーを共染することによって確認する。
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| Causes of Carryover |
本研究では培地や血清等の培養試薬費、ディスポーザブル器具購入費などの消耗品に必要である。さらに本研究の遂行にはタイト結合分子や様々なシグナル分子の各種抗体など多くの一次抗体、二次抗体を必要である。またタンパク質発現ベクターの作製に必要な遺伝子工学試薬費、マウス及びラットの実験動物の維持費に必要である。
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Research Products
(3 results)
