2018 Fiscal Year Research-status Report

肝細胞癌早期再発マーカートランスグルタミナーゼ2の腫瘍生物学的意義と臨床的意義

Research Project

Project/Area Number	18K15102
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	山口裕美日本大学, 医学部, 客員研究員 (90547118)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2020-03-31
Keywords	トランスグルタミナーゼ2 / 肝細胞癌 / 早期再発
Outline of Annual Research Achievements	肝細胞癌は再発率の高い予後不良の癌であり、再発制御因子を見つけその詳細なメカニズムを明らかにすることが治療戦略構築にとって重要である。申請者らは本研究に先立ち、早期再発する肝細胞癌ではトランスグルタミナーゼ2(TGM2)と呼ばれるタンパク質が高発現である事を明らかにした。しかし、TGM2が早期再発の肝細胞癌で高発現する意義及び再発のしやすさを規定するメカニズムには、未だ不明な点も多い。本研究では、TGM2がどのようなシグナル伝達系を介して肝細胞癌の早期再発に働いているのか、TGM2がヒト肝細胞癌の早期再発マーカーとなりうるか、を明らかにする。まずはTGM2高発現肝癌細胞株と低発現株を用いて、cell viability assayを実施した。結果、TGM2高発現細胞で細胞の増殖率が有意に高かった。更に、TGM2と連動して発現変化する一連の遺伝子群を明らかにするため、Gene Chip arrayによる遺伝子発現変化の網羅的解析を行った。TGM2の発現量に応じて1.8倍以上発現量が変化している遺伝子probeは1197個存在し、その中にはDKK family遺伝子群をはじめとする、Wnt/β-catenin signaling pathwayに関与する複数の遺伝子が含まれていた。β-catenin免疫染色の結果、TGM2高発現細胞ではβ-cateninのタンパク質発現が亢進しているようであった。更に、TGF-βスーパーファミリーに属するアクチビンを阻害するFollistatinのmRNA発現量にも変化が見られた。パスウェイ解析の結果からは、SWI/SNF complex 機能に関するクロマチンリモデリングにTGM2発現が関与する可能性が示唆され、TGM2がこれらのシグナル伝達系を介して肝細胞癌の増殖・早期再発に働いている可能性が示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究では、適切なTGM2高/低発現肝癌細胞株を用いることが必要である。そのため、まずは複数の肝細胞癌株に対し、リアルタイムq-PCR法によるmRNAの定量及び、ウェスタンブロット法によるタンパク質発現定量を実施してそれぞれの細胞株のTGM2発現量を検証した。これらの予備実験を行ったうえで、以後の実験に適した肝細胞癌細胞株を選定するまでに時間を要したため、当初の実験計画より遅れが生じている。
Strategy for Future Research Activity	当初は微小環境とTGM2発現量変化の関連性も明らかにするため、TGM2発現肝癌細胞と肝星細胞（線維芽細胞）の共培養も実施する予定であったが、TGM2高/低発現肝癌細胞株を単独で培養した場合の遺伝子発現変化をGene Chip arrayから見出すことができた。そのため、まずはこれら見出された一連の遺伝子の発現変化の意義を明らかにすることを優先する。 TGM2発現に応じてmRNA発現量の変化するこれらの遺伝子群について、タンパク質レベルでの発現量・局在の変化等を確認する。必要に応じてこれらの遺伝子のノックダウン・ノックインを行い、細胞増殖能アッセイ、浸潤アッセイ等を行いながら、これらの遺伝子がTGM2と共に肝細胞癌の悪性化、早期再発に寄与するか検証する。更に、ヒト肝細胞癌組織を用いて、TGM2及び見出された遺伝子群が肝細胞癌再発マーカーとなりうるか、その病理学的意義を探る。
Causes of Carryover	当初は、TGM2高／低発現肝細胞癌株及び線維芽細胞に対し、複数の条件下で培養を行ったうえで、TGM2発現量の違いがもたらす網羅的な遺伝子発現変化をGene Chip array解析により明らかにすることを予定していた。今年度ではTGM2高／低発現肝細胞癌株の単独培養時の遺伝子発現量解析を優先したために、次年度使用額が発生した。今後はarray解析からmRNA発現量の異なるものとして見いだされた一連の遺伝子に対し、タンパク質レベルでの発現解析によるvalidationが必要となる。また、これらの遺伝子と肝細胞癌の性質の変化を結び付けて検証する必要性があるため、次年度では多数の抗体・細胞アッセイキットを用意して解析を進める。