肝細胞癌早期再発マーカートランスグルタミナーゼ2の腫瘍生物学的意義と臨床的意義

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K15102
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 山口 裕美 日本大学, 医学部, 客員研究員 (90547118)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: トランスグルタミナーゼ2 / 肝細胞癌 / 早期再発 / Wnt/β catenin signaling / TGF-β

Outline of Annual Research Achievements

トランスグルタミナーゼ2(TGM2)は、早期再発肝細胞癌の特に癌間質に近接した肝癌細胞で高発現であった。引き続き、TGM2高発現肝癌細胞株(shCont)と低発現株(shTGM2) を用いたin vitroの実験系で、TGM2発現の腫瘍生物学的意義を明らかにすることを目指す。

(1).3D培養でのviability assay…Corning社のスフェロイドプレート4515を用いて3D培養を実施したところ、TGM2の発現量に関わらず全てのwellでスフェロイド形成が観察され、細胞の増殖率にも明瞭な違いは認められなかった。更にMBLライフサイエンスの３次元培養Nano Culture Plate/Dishでも培養を行ったが、こちらでも差がなかった。
(2).異なる血清lot間での2D培養による細胞増殖能の違い…2D, 3D培養とも、shCont-shTGM2間で増殖能やスフェロイド形成能など、腫瘍の悪性化に関わるファクターの大きな差が認められなかったため、異なる血清での培養を行ってみた。結果、血清・培地の違いにより細胞の増殖が異なる可能性が見られた。培地1,2におけるshContのTGM2発現量はほとんど変わらなかったが、培地1ではshCont-shTGM2細胞間で増殖率が一定、培地2ではshCont細胞でより増殖率が高かった。
以上より、血清中の成長因子等、何らかの液性因子の違いに対し、TGM2に関連したシグナル経路が一方の培地においてのみ応答、増殖に違いが認められた可能性がある。生体内でも、癌間質より供給されるTGF-βや、癌-間質相互作用によるWnt/β-cateninシグナルの異常に対しTGM2高発現細胞が応答しているかもしれない。これらのシグナル応答性をin vitro培養系を用いて解析することで、肝癌細胞でのTGM2高発現の意義を明らかにできる可能性が示された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究スタート時に適切なTGM2高/低発現肝癌細胞株の選定・入手に時間がかかったこと、及び、新型コロナウイルス感染症の影響で実験計画が後ろ倒しとなった。

Strategy for Future Research Activity

培養液中に含まれる液性因子に対して、TGM2発現の違いにより応答性が大きく異なる可能性が示された。
そのため、mRNAレベルで発現量の違いが観察できた遺伝子群、特にWnt/β-catenin及びTGF-βシグナルに関連する遺伝子群について、タンパク質レベルでの発現量・局在の変化等を確認していきたい。これらのシグナル伝達系がTGM2と共に肝細胞癌の悪性化、早期再発に寄与するか検証を進めるべく、培養細胞に添加するためのWnt及びTGF-βreconbinantタンパク質を入手したため、培養細胞への添加実験を進める。

Causes of Carryover

当初の予定よりGene Chip array解析を低額で実施することができ、また研究計画に遅れが生じたため次年度使用額が発生した。今後、Wnt/β-catenin及びTGF-βシグナルに関与する遺伝子群の、TGM2発現と連動したタンパク質レベルでの発現変化を観察する予定である。そのため、まずは細胞に添加するWnt, TGF-β等のrecombinantタンパク質を入手した。これらのタンパク質の作用下で発現変化すると思われる各種タンパク質の抗体や染色キットを購入して解析を進める。