2019 Fiscal Year Research-status Report

サルコメア合成機構の解明に基づいた新規的筋萎縮治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	18K15130
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	林地のぞみ順天堂大学, 医学部, 特任助教 (80772433)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	筋委縮 / サルコメア / 筋ジストロフィー / 糖鎖関連因子 / ゼブラフィシュ
Outline of Annual Research Achievements	サルコメアとは骨格筋を構成する最小単位であり。このサルコメアを増減することで筋量を調整している。サルコメアが減少するメカニズムは解明が進められているが、その一方でサルコメアの合成機構は未だ謎が多く、解明が急がれている。申請者は筋再生不良及び筋力低下、筋委縮などサルコペニアに近い症状を呈すること、その原因がサルコメア形成不全を原因とするマウスを見出した。さらにこのマウスから、サルコメア形成に、重要などある因子の同定に成功した。当該因子は現在、サルコメア合成のみならず骨格筋おいて報告がない全く新しい因子である。現在までに本因子が欠損することで筋融合阻害やサルコメア形成阻害、筋損傷遅延がおこることをマウスやゼブラフィッシュを用いたin vivoや株化骨格筋前駆細胞を用いたin vivoと幅広く両観点から今までの実験成果を得ている。サルコメア合成の機構筋ジストロフィーは有効な治療法方が確立されておらず対処療法が主な不治の病である。一方、サルコペニアは原因の治療法も全く不明な疾患である。骨格筋の治療に対してはステロイド等が挙げられるが、本研究はこれら治療法の確立されていない筋疾患に対してサルコメアの合成に着目し新しい治療法に提案することを最終目標とする。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 顆粒球コロニー刺激因子欠損マウスにおいて筋再生がおこらず、老化とともに筋萎縮を呈することに着目し、顆粒球コロニー刺激因子欠損マウスの横隔膜を電子顕微鏡で解析を行ったところサルコメア構造に断裂や消失といった異常が認められた。そこから、顆粒球コロニー刺激因子シグナルの顆粒にサルコメア形成に関与する因子が存在すると仮定し、G-CSFを添加することで遺伝子発現変化する因子をRNA chipを用いて探索した。結果、糖鎖関連修飾因子が変異することを突き止めた。次に、本因子が本当にサルコメア形成に関与している因子であるか全身性の欠損マウスが既に樹立されていたためマウスを用いて解析を行うこととした。本マウスはnull個体で維持できずhetero個体で得るしかないが出生直後7割のnullマウスが死亡するなど非常に強い表現系を呈する。そこで胎生18.5日齢のマウスを解析することとした。胎生18.5日齢においてWild, Hetero, Nullに体重差は発生に影響はなかった。しかし、横隔膜ではサルコメアが断裂・消失が認められ、大腿部で筋管形成の異常が認められるなど特定した因子がサルコメア形成に関与していることが確認された。
Strategy for Future Research Activity	本年度はまず骨格筋において当該因子が行っている糖鎖修飾蛋白の同定をおこなう。具体的には特殊な糖鎖構造をとっている蛋白をMAS解析により同定する。同定した因子候補は初代培養と株化骨格筋前駆細胞を用いてsiRNAにより今回標的とする因子が実際に標的因子であるかの確認を行う。現在までは全身性の欠損マウスを用いて組織や筋力の評価を行ってきた。しかし本因子は神経系にも作用することが知られていることから骨格筋に直接的に作用しているかは不明であった。このために、目的の因子の骨格筋のコンディショナル欠損マウスを用いて組織や筋力で同様の表現型を呈するか検証す必要がある。具体的には、骨格筋のアクチンのCreマウスに標的因子のfloxマウスを交配させて骨格筋組織特異的欠損マウスを作成する。作製したマウスは、電子顕微鏡解析を含めた組織解析、運動機能解析、呼吸機能解析を行う。本研究にはICRと非近交系マウスを使用している。そのため遺伝子背景をそろえるためゼブラフィシュでモルフォリノを用いて検証を同時に行う。また、ゼブラフィシュは胚が透明であるため発生期における同定因子の発現パターンをインサイチュウハイブリダイゼーションで検証を行う。
Causes of Carryover	最終年度は研究費が配分される額より高くなるため、近年度の実験に使用するため。